富血小板血漿促進兔橈骨創(chuàng)傷性骨折愈合作用研究

賈春志， 金紅旭， 韓龍飛， 王 玲

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部，遼寧 沈陽 110016

遭受外傷或暴力時發(fā)生的骨折為創(chuàng)傷性骨折，受傷肢體可產(chǎn)生疼痛、腫脹和瘀斑，并伴有肌腱損傷、血管損傷及關(guān)節(jié)脫位等。骨折愈合包括血腫期、炎癥期、骨痂形成期和骨質(zhì)再塑期4個階段。盡早給予治療，進行功能鍛煉，爭取早期愈合，避免形成畸形，喪失功能[1]。富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)是從自體全血中提取的富含血小板的血漿制品，含有多種生長因子，可降低炎癥、感染的發(fā)生，促進骨和軟組織的再生[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，PRP對慢性傷口或術(shù)后切口有促進抗菌活性的作用。在骨折愈合方面，PRP可通過分泌多種細胞因子以促進骨折的愈合[2]。目前，PRP促進骨折愈合的具體機制尚未明確。本研究旨在探討PRP對創(chuàng)傷性骨折愈合的促進作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 健康新西蘭大白兔10只，6～8個月齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不限，單籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為普通級，由青島康大生物科技有限公司提供。電子萬能試驗機(島津 AG-20K1VA)，電泳儀(南京普陽儀器研究所)，轉(zhuǎn)印電泳槽(南京普陽儀器研究所)，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(南京普陽儀器研究所)，聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀(北京賽唯斯科技有限公司)，PCR試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)，甘氨酸、丙烯酰胺、麗春紅、考馬斯亮藍、GAPDH、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)和Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)等抗體均購自Santa公司。

1.2 研究方法

1.2.1 PRP的提取 取大白兔耳緣靜脈血2 ml注入乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，700 r/min離心10 min；吸取上清液及1～2 mm紅細胞層轉(zhuǎn)移至另一EDTA抗凝管中，3 000 r/min離心5 min，棄去1/3上清液，將剩余部分吹打混勻即為PRP。按1∶9的比例向PRP中加入10%的CaCl2溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 創(chuàng)傷性骨折模型的建立 應(yīng)用10%水合氯醛，以3 ml/kg行腹腔麻醉，大白兔雙腿備皮并消毒，切開皮膚顯露橈骨中上段，切開骨膜并鋸斷橈骨，造成0.2 cm長的骨缺損，骨折不固定，壓迫止血。將大白兔隨機分為實驗組和對照組，每組各5只。實驗組于骨折處注射0.2 ml/kg的PRP，對照組給予同等劑量的生理鹽水。兩組均逐層縫合并包扎傷口。術(shù)后常規(guī)飲食，肌肉注射青霉素40 000 U/d，連續(xù)注射3 d，2次/d，隔日換藥。術(shù)后第7、14、21、28、35天，實驗組和對照組大白兔的骨折區(qū)分別注射PRP和生理鹽水，各0.2 ml/kg[3]。

1.2.3 行為學(xué)觀察及生物力學(xué)檢測 觀察并記錄新西蘭大白兔術(shù)前與術(shù)后當日、第7天的行走狀態(tài)[3-4]。術(shù)后42 d，通過耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，小心取下完整的雙側(cè)橈骨，置于電子萬能試驗機進行3點彎曲力學(xué)性能實驗。以橈骨骨折處為加力點，支撐跨距為40 mm，加載速度為5 mm/min，根據(jù)載荷-變形曲線計算最大載荷、最大撓度、彈性載荷及彈性撓度[3-4]。

1.2.4 免疫印跡法檢測 以骨折斷端為中心，上下0.5 cm取材[3]。使用RIPA裂解組織，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度[5]。留取部分蛋白進行免疫印跡法檢測，根據(jù)目的蛋白的分子量配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣、電泳(80～130 V)、PVDF膜轉(zhuǎn)膜(80 V，1 h)、封閉(5%脫脂奶粉室溫封閉1 h)，一抗(GAPDH，BMP-2和CollagenⅠ均購置于Santa公司，4℃過夜孵育均為1∶200配置)和二抗(購置于Santa公司，室溫孵育2 h，1∶1 000配置)孵育后洗膜3次，ECL發(fā)光。

1.2.5 實時定量PCR檢測 以骨折斷端為中心，上下0.5 cm取材[3]。使用Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，定量PCR擴增后通過公式對數(shù)據(jù)進行處理[5]

2 結(jié)果

2.1 PRP對骨折愈合的作用 行為學(xué)觀察結(jié)果顯示，術(shù)后兩組大白兔的飲食、活動均正常，傷口均Ⅰ期愈合。術(shù)后7 d，傷口縫線自行脫落，實驗組大白兔行走狀態(tài)基本恢復(fù)，對照組大白兔仍有輕微跛行。兩組均無感染、膿腫等并發(fā)癥。

2.2 PRP對骨折愈合的生物力學(xué)影響 術(shù)后42 d，實驗組大白兔最大載荷、最大撓度、彈性載荷及彈性撓度均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

組別最大載荷/N最大撓度/mm彈性載荷/N彈性撓度/mm對照組24.28±5.870.65±0.02206.75±14.930.71±0.08實驗組36.96±4.090.84±0.12223.41±12.170.89±0.21P值<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3 兩組BMP-2與CollagenⅠ檢測結(jié)果比較 免疫印跡法檢測以GAPDH為內(nèi)參，檢測兩組大白兔橈骨中CollagenⅠ和BMP-2的表達。實驗組CollagenⅠ和BMP-2的表達量(灰度值CollagenⅠ∶1.35；BMP-2∶1.63)明顯高于對照組(灰度值CollagenⅠ∶0.84；BMP-2∶0.79)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。實時定量PCR檢測兩組大白兔橈骨中Collagen Ⅰ和BMP-2相關(guān)mRNA的表達。其中，實驗組大白兔CollagenⅠ和BMP-2的mRNA的表達為(0.78±0.13)和(1.36±0.11)，均明顯高于對照組的(0.47±0.16)和(0.96±0.39)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 兩組相關(guān)蛋白表達情況比較

圖2 兩組相關(guān)mRNA表達情況比較

3 討論

骨折愈合是涉及多種因子及成骨細胞、破骨細胞等多種細胞代謝的復(fù)雜過程，需要穩(wěn)定的微環(huán)境。理想的骨折愈合應(yīng)具備4個條件，即具有骨誘導(dǎo)性的生長因子、骨誘導(dǎo)信號通路的應(yīng)答細胞、完整充足的血管和供細胞粘附增殖的支架。新西蘭大白兔前肢橈骨骨折模型較好地模擬臨床上的創(chuàng)傷性骨折，對臨床治療起指導(dǎo)作用。

載荷是衡量骨骼所能承受外力的指標，其數(shù)值與骨的強度成正比；撓度是反映骨骼柔韌性的指標，其數(shù)值與骨基質(zhì)中膠原蛋白的含量有關(guān)[6]。本研究通過對生物力學(xué)指標的檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組大白兔橈骨的最大載荷、最大撓度、彈性載荷和彈性撓度值均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這說明，PRP有助于重建骨組織結(jié)構(gòu)，改善骨質(zhì)量，促進骨骼強度和韌性的恢復(fù)。在對下頜骨缺損的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，PRP能夠加速骨形成，提高骨密度[7]。在新西蘭大白兔橈骨缺損的研究中，通過X線與HE染色發(fā)現(xiàn)，硫酸鈣(calcium sulfate, CS)與PRP聯(lián)合應(yīng)用能夠促進成骨因子的釋放，加速骨生成并提高新生骨的強度，效果優(yōu)于單純CS治療[8]。本研究結(jié)果與上述結(jié)論相似。PRP促進創(chuàng)傷性骨折愈合的作用機制可能是其中的血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等與骨髓基質(zhì)干細胞和骨祖細胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合以發(fā)揮作用，刺激骨再生和修復(fù)[9-12]。CollagenⅠ在骨組織中約占骨膠原總量的95%，是骨形成過程中基本的骨基質(zhì)蛋白，影響骨的強度和柔韌性，在骨結(jié)構(gòu)重塑的過程中發(fā)揮重要作用[13]。免疫印跡法和實時定量PCR的測定結(jié)果顯示，實驗組大白兔橈骨中CollagenⅠ的表達顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明，PRP促進了骨組織的修復(fù)，對創(chuàng)傷性骨折的愈合具有積極作用。TGF-β能夠促進成骨細胞中CollagenⅠ的合成，不僅有利于創(chuàng)傷愈合和骨形成過程中膠原基質(zhì)、成骨細胞的沉積，還能抑制破骨細胞的形成和骨吸收，從而加速骨折的愈合。BMP是TGF-β超家族中的一員，能夠有效調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖和分化，具有較強的骨誘導(dǎo)活性，在骨缺損的修復(fù)中具有重要作用[14]。PRP中含有大量的生長因子，如PDGF、TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)等，能誘導(dǎo)骨髓源性間充質(zhì)干細胞的成骨分化，干擾破骨細胞的活化和分化，減少破骨細胞介導(dǎo)的骨膠原降解，在骨缺損的修復(fù)和重塑中發(fā)揮積極作用[15]。IGF-Ⅰ可促進骨膠原的合成、分泌以及成骨細胞的分化，IGF-Ⅱ能夠促進軟骨細胞的增殖[16]。本研究中，免疫印跡法和實時定量PCR的測定結(jié)果顯示，實驗組大白兔橈骨中BMP-2的表達顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明，PRP有助于上調(diào)BMP-2的表達水平，促進骨折的早期愈合。

綜上所述，PRP中大量的生長因子有助于上調(diào)CollagenⅠ和BMP-2的表達水平，從而加速創(chuàng)傷性骨折的愈合。PRP作為一種生物制劑，具有制備簡便、成本耗費低、無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點，但今后尚需要大樣本的臨床研究以證實PRP的應(yīng)用效果及其作用的最佳劑量。