核桃中血清素的提取分離與抗心肌缺血活性研究

陳 晨 徐德平 金 蒙 張曉娟

(江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

核桃(JuglansregiaL)又名胡桃、羌桃。中醫(yī)認為，核桃具有健腦益智，補腎固精，溫肺定喘的作用[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，核桃還具有抗氧化[2-3]，調(diào)節(jié)膽固醇，降低血壓，預(yù)防心腦血管疾病的功效[4-5]，是公認的“黃金圣果”。

有關(guān)核桃生理功能的研究報道較多，相對應(yīng)的功效成分報道卻較少，如核桃具有抗心腦血管疾病的功能，大量文獻[6-7]表明是核桃油中不飽和脂肪酸起主要作用，但李旭[8]以大鼠高血壓為模型，對比脫脂核桃粉和核桃油的作用效果，發(fā)現(xiàn)脫脂核桃粉的降血壓效果明顯優(yōu)于核桃油，說明脫脂核桃仁中含有抗心腦血管疾病的成分，而有關(guān)此成分的研究尚未見報道。

試驗擬以脫脂核桃仁為原料，采用多種色譜法分離，通過細胞體外功能評價來尋找核桃中抗心血管疾病的功能成分，旨在明確核桃仁中除油以外預(yù)防心血管疾病作用的功效成分，以期為核桃資源的高效利用和深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

脫脂核桃仁：云南省林業(yè)科學院；

SD乳鼠：上海實驗動物研究中心。

無水乙醇、正丁醇、茴香醛、冰醋酸、甲醇、硫酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

MMT母液：美國Sigma公司；

大孔吸附樹脂AB-8型：天津南開大學化學工廠；

MCI填料(100 μm)、ODS-D填料(50 μm)：日本三菱化學公司；

乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)試劑盒：上海銘博生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

雙層玻璃提取罐：RAT-100D型，無錫申科儀器有限公司；

真空泵：MP-201型，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-501型，鄭州華特儀器設(shè)備有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：PYC-30型、96孔板，上?；茖嶒炂鞑挠邢薰?；

高壓滅菌鍋：LDZX-75KBS型，蘇州賽恩斯儀器有限公司；

倒置顯微鏡：XDS1C型，上海萬衡精密光學儀器廠；

冷凍高速離心機：Eppendorf 5810R型，德國 Eppendorf公司；

色譜儀：WATERS 2690型，美國沃特世公司；

紫外檢測器：WATERS 996型，美國沃特世公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃功能成分的提取 取20 kg脫脂核桃仁，粉碎后過30目篩，每次取10 kg放入提取罐中，按料液比1∶10(g/mL)加入體積分數(shù)70%的乙醇，于70 ℃，120 r/min攪拌提取2 h，過濾，濾渣重復提取兩次，合并濾液，于70 ℃減壓濃縮成浸膏，得 1.82 kg乙醇提取物，冷藏備用。取1.0 kg乙醇提取物，加水溶解至1 L，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用1 L乙酸乙酯萃取，重復操作4次，將乙酸乙酯相合并于50 ℃減壓濃縮至干，得核桃乙酸乙酯萃取物173.1 g。

1.2.2 乙酸乙酯萃取物的分離 取1.2.1中全部乙酸乙酯萃取物，溶解于適量去離子水中，上大孔樹脂柱AB-8(10 cm×150 cm)，依次用體積分數(shù)為30%，50%，70%乙醇洗脫，每梯度洗脫2 000 mL。將各部分洗脫液減壓濃縮，得30%乙醇洗脫物49.7 g，50%乙醇洗脫物38.2 g，70%乙醇洗脫物32.1 g。

1.2.3 大孔樹脂柱分離組分的抗心肌細胞缺血活性的測定 取20只新生乳鼠，參照文獻[9]的方法制備心肌細胞，平均分為正常對照組、缺血/再灌注模型組與體積分數(shù)30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇洗脫物試驗組。

(1) 心肌細胞存活率的測定：按照文獻[10]配制模擬缺血液。先向缺血液中充入95% N2與5% CO2飽和15 min，置換正常培養(yǎng)基，放入自制密封盒內(nèi)，再通入95% N2與5% CO2，直至充分排盡盒中原有氣體，密封，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，造成心肌細胞缺血缺氧。再灌注時以復氧血液置換缺血液，通入95% O2與5% CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。采用MTT法[11]測定心肌細胞存活率。將細胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，每組設(shè)置5個復孔，經(jīng)缺血/再灌注和藥液干預(yù)后，吸出培養(yǎng)液，細胞用磷酸緩沖液輕輕漂洗3次，再向每孔中加入100 μL含有0.5 g/L MTT母液的溶液，培養(yǎng)4 h，再次吸培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至暗處操作，依次向每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL，低速振蕩10 min，于酶標儀中測吸光度。

(2) 心肌細胞受損程度的測定：采用試劑盒測定心肌細胞酶水平，取每孔內(nèi)的細胞培養(yǎng)上清液，參照說明書操作，比色法檢測細胞上清中LDH、CK的含量。

1.2.4 大孔樹脂柱分離的具有抗心肌缺血活性組分的分離 取大孔樹脂分離的具有抗心肌缺血活性的50%乙醇洗脫物35 g，用適量去離子水溶解，上MCI Gel柱(5 cm×100 cm，100 μm)，依次用500 mL去離子水清洗，體積分數(shù)為45%，50%，55%的乙醇各500 mL梯度洗脫，每梯度收集25支試管，20 mL為一試管。洗脫液經(jīng)薄層色譜(TLC)鑒定，用硫酸茴香醛染色，相同Rf值和顯色情況的洗脫液合并，分別得45%，50%，55%的乙醇洗脫物6.5，10.4，5.2 g。

1.2.5 MCI Gel柱分離組分的抗心肌缺血活性檢測 按1.2.3的方法對MCI Gel柱分離得到的45%，50%，55%的乙醇洗脫物抗心肌缺血活性進行檢測。

1.2.6 抗心肌缺血活性組分分析 采用高效液相色譜(HPLC)對MCI Gel柱分離得到的具有抗心肌缺血活性組分的洗脫物的化學組成進行分析。色譜條件：色譜柱Symetry C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流動相：0 min，100%水(含0.2%甲酸)；20 min后，50%甲醇+50%水(含0.2%甲酸)；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；紫外檢測器波長260 nm。

1.2.7 抗心肌缺血活性單體化合物純化與結(jié)構(gòu)鑒定 取MCI Gel柱45%的乙醇洗脫物5.8 g溶于適量去離子水中，上樣至ODS柱(3.5 cm×100 cm，50 μm)，依次用體積分數(shù)40%，45%，50%乙醇梯度洗脫，得兩個純的單體化合物Ⅰ、Ⅱ，分別為153.1，82.3 mg。將Ⅰ、Ⅱ用二甲亞砜(DMSO)溶解后進行1H-NMR、13C-NMR測定。

1.2.8 單體化合物的抗心肌缺血活性作用研究 參照文獻[9]的方法制備心肌細胞，平均分為10組：正常對照組、缺血/再灌注模型組、試驗組(8組)。對照組為正常培養(yǎng)細胞，模型組經(jīng)缺血再灌注過程，試驗組經(jīng)缺血再灌注過程后再分別灌注單體化合物Ⅰ、Ⅱ，劑量為50，100，150，200 mg/L。心肌細胞存活率及細胞培養(yǎng)液中LDH、CK含量測定方法同1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂柱分離組分的抗心肌細胞缺血活性

由表1可知，各試驗組中，體積分數(shù)50%乙醇試驗組的乳鼠心肌細胞存活率最大，LDH和CK酶含量最低，表現(xiàn)出的抗心肌缺血活性最強，且與模型小鼠存在顯著性差異(P<0.01)。而體積分數(shù)30%，70%乙醇試驗組的細胞存活率、LDH和CK酶含量與模型組相比均無明顯差異，說明不含抗心肌缺血活性成分。由此推斷核桃乙醇提取物乙酸乙酯萃取物有抗心肌缺血活性，且有效成分位于體積分數(shù)50%乙醇洗脫物中，故對體積分數(shù)50%乙醇洗脫物進一步分離。

2.2 MCI Gel柱分離組分的抗心肌細胞缺血活性

由表2可知，各試驗組中，體積分數(shù)45%乙醇洗脫物作用后的乳鼠心肌細胞存活率最大，LDH和CK酶含量最低，表現(xiàn)出的抗心肌缺血活性最強，且與模型小鼠存在顯著性差異(P<0.01)。而體積分數(shù)50%，55%乙醇洗脫物作用后，細胞存活率、LDH和CK酶含量與模型組相比均無明顯變化，說明不含抗心肌缺血活性成分。由此推斷經(jīng)MCI Gel柱分離的45%乙醇洗脫物有抗心肌缺血活性，故對體積分數(shù)45%乙醇洗脫物進行成分分析和分離純化。

表1 大孔樹脂柱分離組分對缺血/再灌注心肌細胞存活率及LDH、CK酶含量的影響?Table 1 Effects of separation of different components on macroporous resin column on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme contents in ischemia/reperfusion

? # 表示與缺血/再灌注模型組比較差異顯著(P<0.01)。

表2 MCI Gel柱分離組分對缺血/再灌注心肌細胞存活率及LDH、CK酶含量的影響?Table 2 Effects of MCI Gel column separation components on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme contents in ischemia/reperfusion

? # 表示與缺血/再灌注模型組比較差異顯著(P<0.01)。

2.3 45%乙醇提取物組成成分

核桃抗心肌缺血活性成分存在于經(jīng)MCI Gel柱分離的45%乙醇洗脫物中，對該洗脫物進行HPLC分析，由圖1可知，45%乙醇洗脫物主要由兩個峰組成，保留時間分別為1.56，1.94 min，推測該部分主要由兩個化合物組成。

圖1 45%乙醇洗脫物液相色譜圖Figure 1 45% ethanol eluate in HPLC

2.4 核桃中抗心肌缺血活性單體化合物的分離

將MCI Gel柱45%乙醇洗脫物反復上ODS柱，依次用40%，45%，50%乙醇洗脫，直到分離出該組分所含的兩個單體化合物Ⅰ、Ⅱ，化合物Ⅰ對應(yīng)保留時間為1.94 min，化合物Ⅱ?qū)?yīng)保留時間為1.56 min。由圖2可知，兩個化合物的薄層色譜圖均呈單一條帶。

圖2 單體化合物薄層色譜圖Figure 2 Thin layer chromatography of compound Ⅰ&Ⅱ

2.4.1 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅰ為白色無定形粉末，溶于甲醇、乙醇，極易溶于水。ESI-MS得出m/z：178 [M+H]+，化合物Ⅰ分子量為177，表明含有奇數(shù)個N元素。

1H-NMR譜可知：δ3.72，2.80含兩個各為三分峰的亞甲基，偶合常數(shù)皆為6.9，表明兩個亞甲基相連；芳香區(qū)有4個氫信號，δ6.76(1H，dd，J=2.3，8.7)，δ6.99(1H，d，J=2.3)，δ7.23(1H，d，J=8.7)各含1個氫，由偶合常數(shù)可知，其構(gòu)成一個AMX系統(tǒng)，即苯環(huán)上三取代氫；δ6.78的氫為單峰氫。

13C-NMR譜中共10個碳：δ151.5為苯環(huán)上連氧碳，判斷有-OH基存在，δ127.4，115.4，114.4，105.8為4個-CH上的碳，δ134.5，130.7，113.9為3個季碳。δ64.8，30.4為2個-CH2上的碳，從δ64.8的化學位移來看-CH2上碳連有氧，推斷有-CH2CH2OH結(jié)構(gòu)片斷。綜合分析并參照文獻[12]得化合物Ⅰ為5,10-二羥色胺，其碳譜如圖3，結(jié)構(gòu)如圖4。

圖3 化合物Ⅰ碳譜圖Figure 3 Carbon spectrum of compound Ⅰ

圖4 化合物Ⅰ的結(jié)構(gòu)Figure 4 The chemical structures of compound Ⅰ

2.4.2 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物Ⅱ為白色無定形粉末，溶于甲醇、乙醇，極易溶于水。ESI-MS得出m/z：203 [M+H]+，HR-ESI-MS得出m/z：203.274 7[M+H]+，對應(yīng)的分子式為C12H14N20。

1H-NMR譜顯示：1個雙峰甲基δ1.57(J=5.4)，δ4.60 處有1個四重峰質(zhì)子(J=5.4)，推測甲基與該質(zhì)子相偶合；δ2.83，3.61處各有2個質(zhì)子(-CH2)，皆呈三重峰(J=6.4)，表明-CH2相鄰；在低場區(qū)δ6.78(dd，J=2.4，8.7)，6.91(d，J=2.3)，7.27(d，J= 8.7)各有1個氫，從偶合常數(shù)來看，其構(gòu)成一個AMX系統(tǒng)，即苯環(huán)上三取代氫。

13C-NMR譜顯示該化合物共有12個碳：其中δ151.0 為苯環(huán)上連氧碳，判斷苯環(huán)上有-OH存在；δ114.4，114.0，104.7為苯環(huán)上的3個-CH上的碳；δ133.4，133.3，128.2，106.9為4個季碳；δ51.2為-CH上的碳，從化學位移來看該碳與N元素相連；δ43.1，19.8為兩個-CH2上的碳，結(jié)合氫譜來看兩個-CH2上碳相連；δ43.1的碳可能也與N元素相連，推斷有-CH2CH2N 結(jié)構(gòu)片斷；δ18.6為甲基。綜合分析1H-NMR、13C-NMR和MS的圖譜并參照文獻[13-14]得出化合物Ⅱ為Shepherdine，其碳譜如圖5，結(jié)構(gòu)如圖6。

圖5 化合物Ⅱ碳譜圖Figure 5 Carbon spectrum of compound Ⅱ

圖6 化合物Ⅱ的結(jié)構(gòu)Figure 6 The chemical structures of compound Ⅱ

2.5 單體化合物的抗心肌缺血活性

由表3可知，模型組細胞存活率僅為26.45%，同時心肌細胞液中LDH、CK含量顯著升高，分別達到45.68%和22.76%，可見缺血/再灌注導致心肌細胞明顯損傷。5,10-二羥色胺劑量為50 mg/L時，細胞存活率為59.46%(P<0.05)、LDH和CK含量顯著降低(P<0.05)；5,10-二羥色胺劑量為150 mg/L時，心肌細胞存活率高達87.79%(P<0.01)，LDH、CK含量達到最低(P<0.01)，且呈劑量依賴關(guān)系；在200 mg/L時，心肌細胞存活率有所下降。表明5,10-二羥色胺對缺血/再灌注造成的心肌細胞損傷具有有效保護作用，150 mg/L時作用效果最佳。Shepherdine組細胞存活率與模型組相當，隨著含量升高對缺血/再灌注損傷心肌細胞無明顯作用。

表3 化合物Ⅰ、Ⅱ?qū)θ毖?再灌注心肌細胞存活率及LDH、CK酶含量的影響?Table 3 Effects of compounds I and II on myocardial cell survival rate and LDH and CK enzyme content in Ischemia/Reperfusion

? * 表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)；** 表示與對照組比較差異極顯著(P<0.01)；# 表示與缺血/再灌注模型組比較差異顯著(P<0.05)；## 表示與缺血/再灌注模型組比較差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論

試驗利用乙醇提取，乙酸乙酯萃取，多種色譜法分離，采用乳鼠缺血再灌注損傷細胞模型篩選，從核桃中得到了血清素5,10-二羥色胺與Shepherdine兩個化合物，其中5,10-二羥色胺對心肌細胞損傷具有良好的保護作用，能夠提高細胞存活率，減少心肌細胞培養(yǎng)液上清中心肌酶(LDH、CK)的釋放，緩解心肌細胞損傷，表明5,10-二羥色胺是核桃仁中有益于心血管作用的功效成分，進一步表明核桃預(yù)防心腦血管疾病作用除多不飽和脂肪酸外，5,10-二羥色胺也是重要的活性成分。

有關(guān)5,10-二羥色胺對心血管的作用已有較多的報道[15-16]，研究首次從核桃中分離鑒定出此成分，為核桃抗心血管疾病提供了新的思路。但該成分的量效關(guān)系和作用機制尚未明確，有待進一步研究。