大豆Kunitz胰蛋白酶抑制因子單克隆抗體的制備與鑒定

王 耀 李燕虹 曹金博 孫亞寧 邢云瑞 陳秀金 鄧瑞廣 胡驍飛

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

大豆含有豐富的蛋白質和油脂資源，是重要的食品和飼料加工原料，但其也含有多種抗營養(yǎng)因子和致敏蛋白[1]，這些物質可能誘發(fā)過敏反應，降低大豆營養(yǎng)價值，影響大豆利用效率[2]。大豆胰蛋白酶抑制因子(Soybean trypisin inhibitor，STI)是其中重要的一種，主要包括Kunitz胰蛋白酶抑制因子(Kunitz trypsin inhibitor，KTI)和Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk trypsin inhibitor，BBI)兩種類型，分別約占大豆蛋白總量的1.4%，0.6%[3]。STI雖已被證明具有抗癌和抗炎生物活性[4]，在醫(yī)藥領域具有潛在應用價值[5]，但其也可抑制機體胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性，導致消化不良，阻礙生長發(fā)育[6]。因此建立特異、高效的檢測方法來監(jiān)測大豆及其制品中STI的含量顯得尤為重要。

目前，胰蛋白酶抑制因子多采用脲酶檢測法、酶化學分析法進行檢測，但是這些檢測方法的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性較差[7]。近年來，利用特異性抗體建立起來的酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)能夠準確、靈敏地檢測STI含量，已成為STI快速檢測方法研究的主要趨勢[8]。張國龍等[9]利用兔源多克隆抗體建立了可用于大豆和大豆產(chǎn)品中KTI定量檢測的直接競爭ELISA方法；邢春芳等[10]也利用兔源多克隆抗體建立了STI的間接競爭ELISA檢測方法，能夠代替酶化學分析法用于豆粕及豆制品中胰蛋白酶抑制因子的檢測。而單克隆抗體(Monoclonal antibody，mAb)相對于多克隆抗體具有均一性和特異性強等優(yōu)勢，更有利于建立靈敏、特異的ELISA方法。目前已有相關研究[11-12]利用mAb建立了用于KTI定量分析的ELISA檢測方法，但缺乏對抗體免疫學特性的鑒定與描述。試驗擬通過動物免疫和細胞融合，篩選穩(wěn)定分泌KTI mAb的雜交瘤細胞株，并對所制備抗體的效價、亞型、敏感性、親和力、特異性等免疫學特性進行鑒定，旨在為建立KTI的ELISA檢測方法及其他免疫學檢測方法提供可靠的抗體保障，為大豆及其制品中KTI的高效監(jiān)測提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑溶液

弗氏佐劑(Freund’s complete/incomplete adjuvant，F(xiàn)CA/FIA)，KTI、BBI、大豆凝集素(Soybean agglutinin，SBA)、大豆球蛋白(Glycinin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)等標準品，鼠源mAb分型試劑：美國Sigma-Aldrich公司；

胎牛血清、選擇性培養(yǎng)基(HAT、HT)、不完全培養(yǎng)基(RPMI-1640)等細胞培養(yǎng)試劑，SDS-PAGE蛋白Marker，酶標羊抗鼠IgG抗體(GaMIgG-HRP)，NC膜等試驗材料：索萊寶生物科技公司；

ELISA所用包被液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，CBS)、稀釋液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，PBS)、封閉液(含5%脫脂奶的PBST溶液)、顯色液(TMB磷酸—檸檬酸緩沖液)、終止液包被液(2 mol/L H2SO4溶液)等溶液：實驗室配置；

其他試劑均為市售分析級試劑。

1.2 主要儀器

電子天平：ME204E型，德國Mettler Toledo公司；

CO2培養(yǎng)箱：INCO153型，德國Memmert公司；

倒置生物顯微鏡：DMI3000型，德國Leica公司；

生物潔凈工作臺：BCM-1000A型，蘇凈安泰有限公司；

酶標儀：iMark450/550型，美國Bio-Rad公司；

蛋白凝膠電泳系統(tǒng)：Mini-PROTEAN型，美國Bio-Rad公司；

轉膜系統(tǒng)：Trans-Blot型，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗動物及骨髓瘤細胞

免疫動物為6～8周齡無特定病原體(SPF)級雌性BALB/c小鼠，液體石蠟預處理的SPF級BALB/c小鼠用于腹水制備。骨髓瘤細胞為小鼠NS0骨髓瘤細胞。

1.4 小鼠免疫及多抗血清鑒定

首次免疫，將KTI與等量FCA混合，取3只小鼠以50 μg/(200 μL·只)的劑量背部皮下多點注射。此后每隔3周加強免疫1次，免疫劑量和方式與首次免疫相同。共進行4次免疫，免疫結束3周后，對小鼠斷尾采血，獲得多抗血清。

多抗血清效價采用間接ELISA進行測定[13]，首先在已包被抗原的酶標板中加入倍比稀釋的抗體，37 ℃孵育15 min，洗板后加入GaMIgG-HRP，37 ℃孵育30 min，洗板后加入顯色液，10 min后終止顯色并讀取OD450 nm值，以測定OD450 nm的P/N值≥2.1判定多抗血清效價(P為陽性孔OD450 nm值，N為陰性孔OD450 nm值)。

多抗血清敏感性采用間接競爭ELISA進行鑒定[13]，首先向酶標板中加入效價測定中OD450 nm值為1.0左右的血清稀釋液和具有梯度抗原標準溶液(作為酶標板上已包被抗原的競爭物)，余下步驟按上述效價測定步驟進行。待酶標儀讀取OD450 nm值之后，求出抑制率B/B0，其中B0為抗原濃度為0時的OD450 nm值，B為抗原不同標準濃度所對應的OD450 nm值。然后將抗原濃度對數(shù)值和抑制率分別作為橫、縱坐標繪制抑制曲線，根據(jù)曲線線性回歸方程計算半數(shù)抑制濃度IC50衡量多抗血清敏感性。

1.5 細胞融合與篩選

復蘇NS0瘤細胞，選取生長狀態(tài)良好的瘤細胞進行擴大培養(yǎng)準備融合。取多抗血清效價高、敏感性好的小鼠進行腹腔注射超免，劑量仍為50 μg/(200 μL·只)，但不加佐劑，超免3 d后，取小鼠脾臟分離脾細胞與NS0細胞進行融合[14]34，將細胞懸液鋪于細胞培養(yǎng)板并進行培養(yǎng)，7 d后用HT培養(yǎng)基半量換液，并密切觀察細胞生長情況，10 d左右抽取細胞培養(yǎng)上清液，同樣采用間接ELISA和間接競爭ELISA進行篩選，挑選效價高、敏感性好、生長旺盛的細胞采用有限稀釋法進行亞克隆[15]，反復篩選直至建立穩(wěn)定分泌KTI mAb的陽性雜交瘤細胞株。

1.6 KTI mAb的大量制備及免疫學特性鑒定

擴大培養(yǎng)已篩選的陽性雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞(約106個)腹腔注射經(jīng)液體石蠟預處理的BLAB/c小鼠。待小鼠腹部明顯腫脹時便可用無菌注射器采集腹水，將腹水以5 000 r/min離心10 min，取上清液采用飽和硫酸銨鹽析法純化[14]22，并用PBS透析3 d得到KTI mAb。

抗體免疫學特性鑒定包括效價、亞型、親和常數(shù)、敏感性和特異性5個方面。效價和敏感性鑒定方法同1.3中多抗血清效價測定和敏感性的鑒定。

亞型通過鼠源mAb分型試劑進行鑒定，利用間接ELISA原理將mAb稀釋包被酶標板，然后加入IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM分型試劑，最終根據(jù)OD450 nm值判斷mAb亞型。

親和常數(shù)(Affinity constant，Ka)根據(jù)飽和ELISA法[16]，在不同濃度抗原包被情況下，測定抗體半飽和濃度，按式(1)計算。

Ka=(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)，

(1)

式中：

Ka——親和常數(shù)，L/mol；

n——不同包被濃度的比值；

[Ab]t、[Ab’]t——不同包被濃度下抗體半飽和濃度，mol/L。

特異性通過測定交叉反應率和免疫印跡試驗進行鑒定，交叉反應率通過間接競爭ELISA測定大豆中其他抗營養(yǎng)因子和致敏蛋白競爭物(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、SBA、BBI)的IC50進行計算(交叉反應率CR=KTI的IC50/其他競爭物的IC50)[17]；免疫印跡試驗首先將上述交叉反應競爭物與KTI以同一濃度進行SDS-PAGE，試驗時在同一凝膠上做一重復，一半用于考馬斯亮藍染色并脫色觀察，另一半進行轉膜后，加入抗體37 ℃條件下孵育2 h，經(jīng)過PBST洗滌，再與GaMIgG-HRP孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌后ECL熒光顯色液顯色，將顯色結果與SDS-PAGE結果進行對照，判斷KTI mAb的特異性[18]。

2 結果與分析

2.1 小鼠多抗血清的鑒定

間接ELISA方法測定多抗血清的效價結果(見表1)表明，3只小鼠免疫效果良好，效價均能達到1∶12 800以上，其中1號小鼠免疫效果最為顯著。

表1 多抗血清效價的間接ELISA測定結果Table 1 Titer of mouse antiserum detected by indirect ELISA (OD450 mm)

通過間接競爭ELISA鑒定各小鼠多抗血清的敏感性，其中1號小鼠多抗血清敏感性最好，間接競爭ELISA抑制曲線如圖1所示，KTI對1號小鼠多抗血清產(chǎn)生了明顯的抑制效果，將抑制率B/B0作為縱坐標，KTI濃度對數(shù)值作為橫坐標繪制抑制曲線，得到線性方程，計算抑制率B/B0為0.5時的多抗血清的IC50為157.33 ng/mL。

圖1 KTI對多抗血清的抑制曲線Figure 1 Inhibitive curve for antiserum to KTI

2.2 KTI mAb的制備

根據(jù)免疫小鼠多抗血清效價及敏感性鑒定結果選擇1號小鼠進行細胞融合，初次篩選96孔細胞板中強陽性細胞株，然后轉入24孔細胞板中擴大培養(yǎng)后復篩，挑選強陽性細胞株，將陽性細胞株進行亞克隆，最終篩選到1株效價高、敏感性好的雜交瘤細胞，命名為4E6-E9，經(jīng)過多次凍存與復蘇后，仍能夠穩(wěn)定分泌抗體。通過小鼠體內誘生腹水法得到4E6-E9腹水，純化后用于鑒定抗體的免疫學特性。

2.3 KTI mAb效價的測定

通過間接ELISA測定4E6-E9 mAb的效價結果如表2 所示，3次平行重復測定4E6-E9 mAb效價OD450 nm值較為穩(wěn)定，效價能夠達到1∶1 638 400，相對于小鼠多抗血清有顯著提高，且高于張國龍等[9]制備的兔源多抗血清效價(1∶128 000)。

表2 4E6-E9 mAb效價測定Table 2 Determination of the titer of 4E6-E9 mAb (OD450 nm)

2.4 KTI mAb亞型的鑒定

采用mAb分型試劑通過間接ELISA方法對4E6-E9 mAb亞型進行鑒定，結果如圖2所示，根據(jù)分型試劑與4E6-E9 mAb結合的OD450 nm值判斷獲得抗體亞型，結果IgG1分型試劑對應的OD450 nm值最高，且其他分型試劑對應的OD450 nm值均較小，說明所制備的4E6-E9 mAb亞型為IgG1型。

圖2 4E6-E9 mAb亞型鑒定Figure 2 Identification of subtype of 4E6-E9 mAb

2.5 KTI mAb親和常數(shù)的測定

將KTI以5，1 μg/mL兩個濃度分別包被ELISA酶標板，通過ELISA飽和法繪制的親和常數(shù)測定曲線如圖3 所示，5 μg/mL包被時，4E6-E9 mAb與KTI結合達到半飽和狀態(tài)的濃度為794.18 ng/mL；1 μg/mL包被時，4E6-E9 mAb與KTI結合達到半飽和狀態(tài)的濃度為600.96 ng/mL。根據(jù)公式計算可得Ka=1.45×108L/mol，通常Ka>107L/mol即為高親和力抗體[19]，因此試驗所制備的4E6-E9 mAb具有較高的親和力。

圖3 4E6-E9 mAb親和常數(shù)測定曲線Figure 3 Affinity constant measurement curve of 4E6-E9 mAb

2.6 KTI mAb敏感性的鑒定

間接競爭ELISA抑制曲線如圖4所示。由抑制曲線的線性回歸方程可以計算得到4E6-E9 mAb的IC50為28.39 ng/mL，相對于小鼠多抗血清，敏感性有了顯著提升。邢春芳等[10]制備兔源多抗血清所建立的ELISA方法的IC50為360 ng/mL，與其相比，試驗所制備的4E6-E9 mAb 具有較低的IC50，說明單抗的敏感性高于多抗敏感性，更有利于ELISA檢測方法的建立。

圖4 KTI對4E6-E9 mAb的抑制曲線Figure 4 Inhibitive curve for 4E6-E9 mAb to KTI

2.7 KTI mAb特異性的鑒定

由表3可知，4E6-E9 mAb與大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、BBI、SBA的交叉反應率>0.3%，表明4種競爭物與4E6-E9 mAb之間基本沒有交叉反應。

將4種競爭物與KTI進行SDS-PAGE，同一凝膠上做一重復，將所做重復進行免疫印跡試驗。4E6-E9 mAb特異性鑒定結果如圖5所示，對比結果表明4E6-E9 mAb僅與第6泳道KTI蛋白結合，表明試驗所制備的4E6-E9 mAb具有較強的特異性。

表3 4E6-E9 mAb的交叉反應結果Table 3 The cross-reactivity of 4E6-E9 mAb

1. Marker 2. 大豆球蛋白 3. β-伴大豆球蛋白 4. SBA 5. BBI 6. KTI

3 結論

試驗在免疫BALB/c小鼠，獲得效價和敏感性良好的多抗血清基礎上，進行細胞融合，篩選陽性雜交瘤細胞株，得到穩(wěn)定分泌KTI mAb的4E6-E9雜交瘤細胞株。通過體內誘生腹水法制備4E6-E9 mAb，并對抗體免疫學特性進行充分鑒定，其效價達到1∶1 638 400，亞型為IgG1型，親和常數(shù)為1.45×108L/mol，IC50為28.39 ng/mL，且只與KTI特異性結合，與其他抗營養(yǎng)因子和致敏蛋白結合無交叉反應。試驗制備的KTI mAb具備良好的免疫學特性，可用于靈敏、特異的大豆及其制品中KTI免疫學檢測方法的建立，但在具體免疫學檢測方法研究中，仍需對其應用條件和方式進行進一步探索，若將其與功能性納米材料及高通量傳感技術相結合，開發(fā)新型快速檢測方法與裝備，將會為飼料中抗營養(yǎng)因子以及食品中大豆致敏蛋白的高效監(jiān)測提供有力技術支撐。