黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選體系的建立

閆禎昕，尹 非，李雪晨，姜 楠，田金英，葉 菲

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室，北京 100050)

高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是一種嘌呤代謝紊亂。當(dāng)男、女血尿酸水平分別超過7 mg·dL-1及6 mg·dL-1時，可以臨床診斷為高尿酸血癥。中國高尿酸血癥的發(fā)病率逐年上升，患者人數(shù)多，易發(fā)展為痛風(fēng)[1-2]。現(xiàn)有的流行病學(xué)和實驗分析表明，高尿酸血癥不僅僅是痛風(fēng)的直接致病因素，而且還與代謝綜合征、高血壓、腎損傷、脂質(zhì)代謝紊亂、心血管疾病等有著密切聯(lián)系，作為風(fēng)險因素，高尿酸血癥對這些疾病的病程發(fā)展產(chǎn)生重要作用[3-4]。人和禽類體內(nèi)無尿酸酶，體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物為尿酸，而嚙齒類體內(nèi)因有尿酸酶的存在，尿酸最終會被氧化成尿囊素排出體外[5]。治療高尿酸血癥藥物的主要作用靶點是黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase , XOD)，可以催化次黃嘌呤或黃嘌呤，生成尿酸的一種黃素鉬蛋白，廣泛分布于小鼠的各個臟器中[6]。抑制XOD的活性，可以直接降低體內(nèi)尿酸生成量，減低體內(nèi)的血尿酸水平。臨床選擇性XOD抑制劑包括別嘌呤醇(一種嘌呤類抑制劑)及非布索坦(一種非嘌呤類抑制劑)[7-8]。

目前，高尿酸血癥模型動物主要為嚙齒類和禽類[5]。根據(jù)尿酸的生成及排泄路徑，造模方式主要包括增加尿酸前體物質(zhì)的攝入、抑制嚙齒類動物的尿酸酶、減少尿酸排泄?？刹扇我灰蛩卣T導(dǎo)，或多種因素聯(lián)合誘導(dǎo)形成高尿酸血癥動物模型。本研究根據(jù)XOD性質(zhì)，完善了體外XOD抑制劑篩選方法，建立了急性及慢性高尿酸血癥模型等體內(nèi)實驗方法，為基于高尿酸血癥的分子靶點XOD藥物研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 牛奶來源XOD1(CAS 9002-17-9)、微生物來源XOD2(CAS 9002-17-9)、黃嘌呤(xanthine, XA，CAS 69-89-6)、次黃嘌呤(hypoxanthine，CAS 68-94-0)，均購自Sigma公司；氧嗪酸鉀(oteracil potassium，CAS 2207-75-2)，購自美侖生物；非布索坦(febuxostat, FBX，CAS 144060-53-7)，購自TCI公司；別嘌呤醇(allopurinol, ALP，CAS 315-30-0)，購自Alfa Aesar公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、血尿酸(uric acid, UA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、肌酐(creatinine, Cre)、尿素(Urea)測定試劑盒，均購自北京中生北控生物技術(shù)有限公司；XOD活性測定試劑盒，購自南京建成生物科技有限公司。

1.1.2儀器 酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；THZ-C型恒溫振蕩器(江蘇太倉科教儀器廠)；高速低溫離心機(德國Heraeus公司)；pH計(美國Fisher Scientific公司)。

1.1.3實驗動物 ICR小鼠，♂，購于北京維通利華生物科技股份有限公司，許可證編號為SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所實驗動物管理中心，飼養(yǎng)溫度為(22～25) ℃，濕度為40%～60%，每天光照時間和黑暗時間各為12 h，進食及飲水自由。小鼠經(jīng)過動物倫理委員會批準(zhǔn)，動物使用許可證編號：SYXK(京)2014-0023。

1.2 方法

1.2.1血清生化測定 3 500 r·min-1離心小鼠全血4 min，取出上層血清，按照試劑盒說明書對UA、AST、ALT、Cre、Urea、XOD進行測定。

1.2.2組織XOD活性測定 取出組織，加入適量預(yù)冷的生理鹽水，冰水浴條件下，機械勻漿，按試劑盒說明書測定組織XOD活性。

1.2.3黃嘌呤氧化酶抑制劑體外篩選模型 分別選用牛奶和微生物為酶來源的兩種XOD作為篩選模型研究對象，分別探究反應(yīng)體系中酶濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值和反應(yīng)時間的影響，根據(jù)終產(chǎn)物尿酸在293 nm處的吸光度，選出最適宜的反應(yīng)條件，并分別測定陽性藥非布索坦和別嘌呤醇的IC50值，選定最適宜的酶來源。

1.2.4急性高尿酸血癥小鼠模型 單次灌胃次黃嘌呤500 mg·kg-1聯(lián)合皮下注射氧嗪酸鉀300 mg·kg-1。設(shè)正常小鼠為正常對照組(Control)，灌胃給予純水及皮下注射溶劑0.5% CMC-Na混懸液。將誘導(dǎo)小鼠隨機分成模型對照組(Mod-A)和非布索坦組(Mod-A-FBX)，分別灌胃給予純水和非布索坦2 mg·kg-1。同時，造模前取血，測定全部小鼠血尿酸水平作為0 h點，之后分別于給藥后1、2、4 h時取血，測定小鼠血尿酸水平。并于4 h取血之后脫頸處死小鼠，取血清測定AST、ALT、Cre、Urea和XOD活性，并迅速取出小鼠肝臟放置于液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于測定肝XOD活性。

1.2.5慢性高尿酸血癥小鼠模型 多次皮下注射氧嗪酸鉀300 mg·kg-1。誘導(dǎo)期間，分別于d 7、9、11、13、14，通過內(nèi)眥取血測定血尿酸水平。設(shè)正常ICR小鼠為對照組(Control)，取血尿酸值穩(wěn)定且高于180 μmol·L-1的動物作為慢性高尿酸血癥小鼠模型(Mod-C)，內(nèi)眥取血之后脫頸處死小鼠，測定血清AST、ALT、Cre、Urea；取小鼠腎臟和肝臟左外側(cè)葉進行病理分析，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色；并快速取肝中葉、心臟、脾、肺、腎和小腸等重要組織，置于液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測各組織中XOD的活性。將誘導(dǎo)小鼠隨機分為模型對照組(Mod-C)和非布索坦組(Mod-C-FBX)，分別灌胃給予純水和非布索坦2 mg·kg-1，每天給藥及造模1次，連續(xù)5 d，觀測血尿酸水平、血清XOD活性、肝組織XOD活性的變化情況。

2 結(jié)果

2.1 XOD抑制劑體外篩選模型的建立常見的XOD分別為牛奶(XOD1)和微生物(XOD2)來源。室溫下分別選擇1、3、5 U·L-1的XOD1或XOD2，固定底物XA 100 μmol·L-1、反應(yīng)時間30 min、pH 7.4的反應(yīng)體系，觀察不同濃度XOD的反應(yīng)情況。Fig 1A結(jié)果顯示，相同濃度的XOD1、XOD2反應(yīng)效果相似；XOD1濃度為3、5 U·L-1的反應(yīng)體系的OD值無明顯差異，均明顯高于其濃度為1 U·L-1的反應(yīng)體系；XOD2的3種反應(yīng)體系結(jié)果亦然。因此，選取3 U·L-1為XOD1或XOD2為最適反應(yīng)濃度。

室溫下，分別選擇25、50、100 μmol·L-1的底物XA濃度，固定XOD1或XOD2 3 U·L-1、反應(yīng)時間30 min、pH 7.4的反應(yīng)體系，觀察不同濃度底物XA的反應(yīng)狀態(tài)。Fig 1B結(jié)果顯示，XOD1和XOD2反應(yīng)體系基本一致，隨著底物濃度的增加，其光吸收度逐漸增加。選擇OD值范圍較適宜的底物XA 50 μmol·L-1為最適的反應(yīng)濃度。

室溫下，固定XOD1或XOD2濃度為3 U·L-1、底物XA 50 μmol·L-1、pH 7.4的反應(yīng)體系，觀察不同作用時間對反應(yīng)體系的影響。Fig 1C結(jié)果顯示，XOD1和XOD2反應(yīng)體系基本一致，選取進入反應(yīng)平臺期的20 min作為最適作用時間。

固定XOD1或XOD2 3U·L-1、底物XA 50 μmol·L-1、反應(yīng)時間20 min、pH 7.4的反應(yīng)體系，觀察不同溫度對反應(yīng)體系的影響。Fig 1D結(jié)果顯示，選取XOD酶活性最高點，則對于XOD1和XOD2反應(yīng)體系的最適作用溫度均為37 ℃。

37 ℃下分別選擇pH為4.4、5.4、6.4、7.4、8.4、9.4的緩沖液，固定XOD1或XOD2 3 U·L-1、底物XA 50 μmol·L-1、反應(yīng)時間20 min的反應(yīng)體系，觀察不同的緩沖液pH對反應(yīng)體系的影響。Fig 1E結(jié)果顯示，對于XOD1和XOD2酶活性最高點的反應(yīng)體系均為pH 7.4。

目前已上市的選擇性XOD抑制劑主要有ALP和FBX。分別應(yīng)用XOD1或XOD2的反應(yīng)體系，測定ALP、FBX抑制XOD的活性。Fig 2結(jié)果顯示，ALP對XOD1和XOD2均具有明顯的抑制作用，其IC50均可達到10-6mol·L-1數(shù)量級；FBX對XOD1的抑制活性較強，其IC50可達到10-9mol·L-1，但對XOD2則沒有明顯的抑制作用。

上述結(jié)果提示，選擇牛奶來源的XOD1 3 U·L-1、底物XA 50 μmol·L-1、反應(yīng)時間為20 min、反應(yīng)溫度為37 ℃、pH為7.4的反應(yīng)體系，F(xiàn)BX為陽性對照藥，從而建立了XOD抑制劑的體外篩選模型。

2.2 急性高尿酸血癥小鼠模型的建立應(yīng)用體質(zhì)量為(24±2)g的♂ICR小鼠，單次灌胃給予次黃嘌呤500 mg·kg-1聯(lián)合皮下注射氧嗪酸鉀300 mg·kg-1，分別于給予陽性藥FBX 2 mg·kg-1后0、1、2、4 h時，內(nèi)眥取血測定小鼠血尿酸水平。以誘導(dǎo)劑溶劑代替誘導(dǎo)劑的動物作為正常對照Control組。Fig 3A結(jié)果顯示，Mod-A組動物的血尿酸值與對照組相比明顯上升，于給藥后1 h時達到峰值，平均增長幅度達到348.2%；而后血尿酸值逐漸下降，于給藥后4 h血尿酸值還原到基線程度；該血尿酸-時間曲線下面積(area under curve, AUC)上升了204.8%(Fig 3B)。灌胃給予陽性藥FBX 2 mg·kg-1治療后，Mod-A-FBX組動物的血尿酸值與Mod-A組相比明顯降低，其血尿酸峰值及AUC值各下降了60.2%及59.6%，顯示FBX具有明顯改良小鼠急性高尿酸血癥的功能。

在FBX給藥后4 h內(nèi)眥取血后，脫頸處死小鼠，迅速分離肝。分別測定血清XOD活性及肝組織XOD活性，結(jié)果顯示(Fig 3C、3D)，對照組、Mod-A組的血清XOD活性及肝組織XOD活性均未呈現(xiàn)明顯差異；Mod-A-FBX組血清XOD活性與Mod-A組相比明顯下降，肝組織XOD活性未見明顯改變。

測定對照組和Mod-A組的肝腎功能血液指標(biāo)，如AST、ALT、Cre和Urea。結(jié)果顯示(Tab 1)，對照組和Mod-A組均未見明顯差異，提示急性高尿酸血癥小鼠模型的肝腎功能未見明顯損傷。

2.3 慢性高尿酸血癥小鼠模型的建立應(yīng)用體質(zhì)量(20±2)g的ICR ♂小鼠，采用連續(xù)多次皮下注射氧嗪酸鉀300 mg·kg-1的誘導(dǎo)方式，每天1次。于誘導(dǎo)后d 7、9、11、13、14，內(nèi)眥取血測定血尿酸水平。以誘導(dǎo)劑的溶劑代替誘導(dǎo)劑刺激的動物作為正常對照(No stimulated)組(n=7)。結(jié)果顯示(Fig 4A)，以氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的小鼠(Stimulated組，n=60)血尿酸水平逐漸升高，連續(xù)誘導(dǎo)2周后，與No stimulated組比較，Stimulated組的平均血尿酸水平升高了約2倍，約70%的動物血尿酸水平超過180 μmol·L-1。

Fig 1 Regulation of XOD activity (A), XA concentration (B), and reaction time (C), temperature (D), pH (E) on absorbance at wavelength 293 nm n=3)

Tab 1 Liver function and kidney function in acute hyperuricemia mice n=10)

慢性高尿酸血癥模型小鼠(Mod-C)(n=10)與同批正常對照小鼠(n=10)比較，血液肝功能指標(biāo)AST和ALT未見明顯差異(Tab 2)；肝臟HE染色(病理分析)未見明顯差異，肝組織結(jié)構(gòu)及細胞排列整齊，未見濁腫及壞死等受損現(xiàn)象(Fig 4B)；血液腎功能指標(biāo)Cre和Urea未見明顯差異(Tab 2)；腎臟HE染色(病理分析)未見明顯差異，腎組織結(jié)構(gòu)清晰，未見水腫及壞死等受損現(xiàn)象(Fig 4C)。說明采用此造模方式形成的慢性高尿酸血癥小鼠模型未見明顯肝腎損傷。

檢測動物主要臟器的XOD活性，結(jié)果顯示(Fig 4D)，對照組、Mod-C組各組織的XOD活性無明顯差異；其各主要臟器XOD活性強弱順序依次為小腸、心臟、肝臟、肺、腎及脾。

Tab 2 Liver function and kidney function in chronic hyperuricemia mice n=10)

Fig 2 Different activities of XOD1 and XOD2 in vitro n=3)

Fig 3 Changes of serum uric acid and XOD activity in acute hyperuricemia mice n=10)

Fig 4 Characters of oteracil potassium-induced hyperuricemia mice

設(shè)正常小鼠作為對照組(Control，n=10)。把慢性高尿酸血癥模型小鼠隨機分為Mod-C組(n=10)和Mod-C-FBX組(n=10)，分別持續(xù)灌胃水及陽性藥FBX 2 mg·kg-1，持續(xù)治療5 d，每天監(jiān)測小鼠血尿酸水平變化情況。結(jié)果顯示(Fig 5A)，Mod-C組的平均血尿酸水平與對照組相比，上升了2.5倍。Mod-C-FBX組動物的血尿酸值與Mod-C組相比，降低大約60%，并保持穩(wěn)定，連續(xù)給藥5 d期間，Mod-C-FBX組動物的血尿酸值均保持與對照組相近的較低水平，顯示FBX具有明顯改善小鼠慢性高尿酸血癥的作用。

在給藥d 5，測定血清XOD活性(Fig 5B)和肝組織XOD活性(Fig 5C)，Mod-C組的血清XOD活性及肝組織XOD活性與對照組相比，各上升了31.3%及10.7%。Mod-C-FBX組的血清XOD活性及肝組織XOD活性與Mod-C組相比，分別下降了39.6%及49.0%。

Fig 5 Effects of febuxostat on serum uric acid and XOD activity in chronic hyperuricemia mice n=7)

3 討論

人類體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物為尿酸。體內(nèi)尿酸超過一定限度則稱為高尿酸血癥。隨著現(xiàn)代人嘌呤類食物攝入增加，高尿酸血癥及其相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年升高[1]。XOD能催化黃嘌呤及次黃嘌呤產(chǎn)生尿酸，是體內(nèi)合成尿酸的限速酶，為抗高尿酸血癥藥物的重要靶點[9-10]。

體外測定XOD活性的方法有多種，包括HPLC法[11-12]，具有靈敏度高、樣品易回收等優(yōu)點，但單次分析樣品數(shù)量少，不適用于同時分析大量樣品；酶動力學(xué)法[13]具有反應(yīng)時間較短的優(yōu)點，但測定結(jié)果易受環(huán)境影響，不穩(wěn)定；酶終點法可同時測定多種樣品的抑制情況，受環(huán)境因素影響較小，結(jié)果重復(fù)性好，適用于測定樣品對XOD活性的抑制情況。本研究中，根據(jù)適宜的反應(yīng)終點OD值，選取最適XOD酶濃度和底物黃嘌呤濃度；動態(tài)觀察反應(yīng)狀態(tài)，選取達到平臺期的時間作為最適反應(yīng)時間，反應(yīng)效率最高的溫度和pH作為最適反應(yīng)體系，建立了體外XOD活性測定方法。分別應(yīng)用已上市的XOD抑制劑別嘌呤醇和非布索坦，使用牛奶來源的XOD1測定其抑制XOD活性的IC50值分別為1.194 μmol·L-1和2.925 nmol·L-1。使用微生物來源的XOD2活性測定方法，嘌呤類經(jīng)典藥物別嘌呤醇抑制XOD活性的IC50值為1.150 μmol·L-1；非嘌呤類新型XOD特異性抑制劑非布索坦沒有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，出現(xiàn)假陰性。因此，選用牛奶來源XOD1 3 U·L-1、底物XA 50 μmol·L-1、反應(yīng)時間為20 min、反應(yīng)溫度為37 ℃、pH為7.4的反應(yīng)體系，F(xiàn)BX為陽性對照藥，建立了XOD抑制劑的體外篩選模型。

在全人類進化過程中，尿酸氧化酶基因序列發(fā)生突變，失去活性[14]，尿酸為體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物，致使體內(nèi)血尿酸上升，使得人類較容易患高尿酸血癥。小鼠的嘌呤代謝過程中，尿酸氧化酶可氧化尿酸生成尿囊素，后者是一種高度水溶性化合物，可高效排出，減少體內(nèi)尿酸的積累。通過增加尿酸前體物質(zhì)的攝入而增加尿酸的合成，抑制尿酸轉(zhuǎn)運體減少尿酸的排泄和抑制尿酸氧化酶作用，均可導(dǎo)致小鼠的血尿酸升高，形成高尿酸血癥模型。

本研究采取單次同時給予大劑量尿酸前體物質(zhì)——次黃嘌呤及競爭性尿酸酶抑制劑——氧嗪酸鉀[15]的方式，誘導(dǎo)ICR小鼠的血尿酸水平一過性上升，形成小鼠急性高尿酸血癥模型。該小鼠模型在給予造模劑后血尿酸迅速上升，通常在誘導(dǎo)2 h后達到峰值；隨后血尿酸水平逐漸下降，于造模劑誘導(dǎo)5 h后恢復(fù)到基線水平。與同批正常對照組比較，該模型小鼠Mod-A組的肝腎功能未見明顯變化，表明此造模方法并不會對小鼠的肝腎功能造成明顯損傷。此外，Mod-A組的血清XOD活性和肝組織XOD活性均未見明顯變化。該模型類似于人類因飲食不節(jié)制，大量攝入嘌呤類食物后，血尿酸出現(xiàn)一過性升高，可通過動態(tài)監(jiān)測血尿酸值變化情況和尿酸-時間曲線下面積AUC，評價受試藥對急性高尿酸血癥的治療作用。

采取連續(xù)多次給予氧嗪酸鉀的方法，使得小鼠血尿酸值逐漸升高，形成慢性高尿酸血癥小鼠模型。該模型使用ICR小鼠，給予氧嗪酸鉀連續(xù)刺激約2周后，與同批正常對照組比較，動物的血尿酸水平逐漸升高，發(fā)生高尿酸血癥的動物數(shù)逐漸增多，血尿酸均值約為正常對照2倍。慢性高尿酸血癥模型小鼠(Mod-C)血尿酸平穩(wěn)升高。Mod-C組血清及肝組織XOD活性和正常對照組相比，均未見明顯變化，肝、腎功能也無明顯變化，肝組織和腎組織的病理檢查(HE染色)亦未見明顯損傷，說明此造模方法對小鼠的肝腎未見明顯損傷?？诜o予XOD抑制劑非布索坦治療后，模型動物的血尿酸水平下降到與正常對照組相近的水平，并保持穩(wěn)定。此慢性高尿酸血癥小鼠模型類似于臨床上高尿酸血癥的情況，可以用于高尿酸血癥藥物的藥效學(xué)評價及其作用機制的探究。

小鼠XOD組織分布相關(guān)報道較少。本研究結(jié)果顯示，ICR小鼠主要臟器均存在XOD的表達，其XOD活性從高到低依次為小腸、心臟、肝臟、肺、腎、脾臟等組織。至于小腸、心臟高活性的XOD的生理功能，有待進一步探討。此外，雖然由氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的慢性高尿酸血癥模型小鼠各組織的XOD活性均未見明顯變化，但是XOD抑制劑非布索坦可明顯抑制該模型動物的血清和肝臟的XOD活性。

總之，本研究建立了包括檢測樣品對體外XOD抑制活性、對急性高尿酸血癥小鼠一過性血尿酸水平上升的影響、對慢性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平“長”期平穩(wěn)上升作用的XOD抑制劑篩選體系。該體系的3種體外、體內(nèi)實驗方法，各自獨立又互相補充、相互驗證受試樣品的降血尿酸能力，為基于分子靶點XOD的抗高尿酸血癥藥物的研發(fā)和作用機制研究奠定了實驗基礎(chǔ)。