Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路及其激活劑的研究進(jìn)展

姚 娟, 吳平安, 李 蕓, 李越峰, 劉東玲, 劉雪楓

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路是一個(gè)綜合的氧化還原反應(yīng)體系，有多個(gè)激活途徑維持細(xì)胞的氧化還原平衡及代謝，它能調(diào)節(jié)機(jī)體1%～10%的基因[1]。機(jī)體內(nèi)的一些酶和蛋白質(zhì)，如NAD(P)H:醌氧化還原酶1、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶-1、過(guò)氧化氫酶、硫氧還蛋白還原酶等，都具有解毒和抗氧化防御功能，這些蛋白及酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控都依賴于Nrf2信號(hào)通路的激活。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路與氧化應(yīng)激相關(guān)的多種疾病，包括癌癥、阿爾茨海默病、帕金森病、糖尿病等都有相關(guān)性[1]。因此，發(fā)現(xiàn)及研究Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活劑，對(duì)于預(yù)防和治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的疾病具有重要意義。

1 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)

1.1 Keap1Keap1是分子質(zhì)量為69 ku的蛋白，它是Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)器。人類Keap1的蛋白質(zhì)序列中包含5個(gè)區(qū)域，由627個(gè)氨基酸組成，如Fig 1所示，包括N端區(qū)域(N-terminal region，NTR)、BTB區(qū)域(broad complex，Tramtrack，and Bric-a-Brac，BTB)、中間連接區(qū)域(linker intervening region，IVR)、Kelch區(qū)域以及C端區(qū)域(C-terminal region，CTR)[2]。BTB區(qū)域附于actin結(jié)合蛋白上，負(fù)責(zé)同源二聚化Cul3與Nrf2泛素化過(guò)程。IVR含有半胱氨酸殘基，對(duì)氧化和核輸出信號(hào)敏感。Kelch區(qū)域擁有介導(dǎo)Keap1與Nrf2連接的多個(gè)蛋白接觸位點(diǎn)。人類Keap1蛋白共包含27個(gè)半胱氨酸殘基(Cys)，其中7個(gè)Cys(Cys151、Cys257、Cys273、Cys288、Cys297、Cys434和Cys613)對(duì)活性氧(reactive oxygen species, ROS)和親電試劑具有較高的活性，可參與氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)[2-3]。

Fig 1 Organization of structure domains in Keap1

1.2 Nrf2Nrf2是bZip轉(zhuǎn)錄因子和CNC轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，人類Nrf2蛋白含有605個(gè)氨基酸殘基，組成從Neh1到Neh6的6個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，如Fig 2所示[4]。Neh1具有bZip序列，負(fù)責(zé)與Maf蛋白的異源二聚化，Nrf2-Maf二聚體可以結(jié)合在ARE上，誘導(dǎo)基因的表達(dá)。在N末端，Neh2區(qū)域包含DLG和ETGE序列，可以結(jié)合在Keap1的Kelch區(qū)域上，負(fù)性調(diào)控Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性。Neh3區(qū)域位于C末端，Neh4和Neh5可以通過(guò)結(jié)合到組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶上，調(diào)解Nrf2的反式激活。Neh6對(duì)Nrf2具有不依賴于Keap1的負(fù)性調(diào)控作用[4]。人類Nrf2蛋白上含有6種半胱氨酸殘基，半胱氨酸(Cys183、Cys506)和另外2個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基(Ser40、Tyr568)也可以通過(guò)氧化磷酸化，調(diào)控Nrf2的定位和目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。所以，Nrf2是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)控器[5]。

Fig 2 Organization of structure domains in Nrf2

1.3 AREARE也被稱為親電效應(yīng)元件，是一種包含特定DNA序列的順式調(diào)節(jié)元件，位于具有細(xì)胞保護(hù)作用蛋白質(zhì)及二相代謝酶基因編碼的上游。在氧化應(yīng)激條件下，穩(wěn)態(tài)化的Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與Maf形成異二聚體，激活A(yù)RE依賴的基因表達(dá)。Bach1是一個(gè)依賴ARE基因的負(fù)調(diào)節(jié)器，它與ARE和Maf蛋白二聚體的形成相關(guān)，阻止Nrf2在正常生理?xiàng)l件下與DNA的結(jié)合[6]。

2 Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的小分子激活劑

目前已知的ARE激活劑基本都是Keap1-Nrf2相互作用的間接抑制劑，它們可與Keap1半胱氨酸上的巰基通過(guò)氧化或烷基化形成共價(jià)加合物。親電性是大多數(shù)已知誘導(dǎo)劑的共同特征[7]，但是并非所有的親電試劑都能調(diào)控ARE的活性。親電試劑的生物效應(yīng)取決于其與親核試劑相互作用的速率和選擇性。加合物的形成不僅依賴于親電試劑的性質(zhì)，還取決于親核中心的蛋白微環(huán)境。不同類型的親電試劑可以在Keap1-Nrf2與蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基中顯示不同的反應(yīng)模式，從而導(dǎo)致不同的生物學(xué)效應(yīng)[8]。親電試劑修飾Keap1的半胱氨酸殘基后，誘導(dǎo)Keap1和Nrf2解離，抑制Nrf2通過(guò)泛素化降解，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位。

基于與Keap1-Nrf2相互作用的小分子抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以及與半胱氨酸巰基作用的性質(zhì)，目前公認(rèn)的可與Keap1-Nrf2相互作用的抑制劑有以下幾類。

2.1 具有氧化性的酚和醌類多酚化合物在作用于Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路前，就可以作為抗氧化劑直接清除自由基。在20世紀(jì)70年代，研究發(fā)現(xiàn)酚類抗氧化劑BHA可誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)酶的表達(dá)。結(jié)構(gòu)修飾BHA得到BHT和tBHQ，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化對(duì)ARE誘導(dǎo)活性的影響非常小。邁克爾受體是ARE的誘導(dǎo)基團(tuán)，因此，可以推測(cè)酚類ARE誘導(dǎo)劑可在氧化后形成類似邁克爾受體，能誘導(dǎo)ARE的相應(yīng)親電性醌類。這一假設(shè)得到3個(gè)異構(gòu)體二酚的支持，通過(guò)測(cè)定兒茶酚(1,2-二酚)、間苯二酚(1,3-二酚)和對(duì)苯二酚(1,4-二酚)的氧化電勢(shì)和誘導(dǎo)ARE的能力發(fā)現(xiàn)，兒茶酚和對(duì)苯二酚可誘導(dǎo)ARE的活性，而間苯二酚無(wú)活性[9]。在氧和過(guò)渡金屬存在情況下，tBHQ被氧化為tBQ，并迅速地與Keap1蛋白進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)，激活A(yù)RE相關(guān)的轉(zhuǎn)錄。也有人認(rèn)為，雙酚經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的氧化反應(yīng)，在體內(nèi)形成醌，促進(jìn)了最終的誘導(dǎo)作用[10]。內(nèi)源對(duì)位及鄰位氫醌，如兒茶酚雌激素、多巴胺和L-DOPA也可以誘導(dǎo)ARE依賴的防御反應(yīng)[10]。

槲皮素存在于許多植物中，是一種來(lái)自植物的黃酮類抗氧化劑。槲皮素可以抑制Nrf2的降解，促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)位入核，以增加細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的水平。白藜蘆醇是主要存在于紅葡萄皮和其他水果中的二苯乙烯類和非黃酮多酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇類似槲皮素，可誘導(dǎo)Nrf2介導(dǎo)ARE基因的表達(dá)[11]。綠茶富含兒茶素多酚，其中含量最豐富的是表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)，它是綠茶發(fā)揮抗氧化作用的主要活性成分。研究表明，EGCG可增加細(xì)胞核中Nrf2的水平，也可誘導(dǎo)ARE熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。鼠尾草酚和它的酸衍生物鼠尾草酸，是從迷迭香中得到的兒茶酚型松香烷二萜，它們被用作食品的防腐劑和抗氧化劑，并能提高Nrf2的水平，減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用和ROS的生成[12]。相對(duì)于鼠尾草酚，鼠尾草酸的保護(hù)作用更為明顯，可能是由于其具有較高的溶解性或較低的毒性。黃芩素是中藥黃芩中的主要成分，研究表明，黃芩素能明顯提高Nrf2的轉(zhuǎn)錄活化[13]。

2.2 邁克爾反應(yīng)受體分子邁克爾反應(yīng)受體分子是一類效果較好的ARE通路激活劑，邁克爾反應(yīng)受體分子被認(rèn)為是溫和的路易斯酸，誘導(dǎo)效力與它們的邁克爾加成反應(yīng)性呈正比。邁克爾反應(yīng)受體分子可以與Keap1上的半胱氨酸硫醇鹽基團(tuán)反應(yīng)，進(jìn)而抑制Nrf2的泛素化，誘導(dǎo)抗氧化和細(xì)胞保護(hù)酶的表達(dá)[14]。邁克爾反應(yīng)受體分子通常在低濃度下表現(xiàn)為有益的細(xì)胞應(yīng)答，高濃度下不會(huì)激活Nrf2信號(hào)通路，并有細(xì)胞毒性。通常在各種植物中存在許多結(jié)構(gòu)上與邁克爾反應(yīng)受體分子有關(guān)的誘導(dǎo)劑，如姜黃素、肉桂酸衍生物、查耳酮、黃酮、萜類化合物等。

姜黃素是印度咖喱的主要成分，結(jié)構(gòu)上有兩個(gè)酚官能團(tuán)和β-二酮結(jié)構(gòu)，姜黃素能直接清除ROS。姜黃素含有兩個(gè)易與半胱氨酸巰基反應(yīng)的邁克爾受體基團(tuán)，它能通過(guò)修飾Keap1上的半胱氨酸巰基，激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路[15]。姜黃素還可間接通過(guò)刺激上游激酶途徑，激活A(yù)RE系統(tǒng)。使用姜黃素作為預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的藥物，主要弊端是其代謝和化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，膜通透性差，口服生物利用度極低。

肉桂酸類衍生物咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是蜜蜂蜂膠中的一種活性成分，它具有抗有絲分裂、抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。阿魏酸及其衍生物如阿魏酸乙基酯(ferulic acid ethyl este，EFE)，多存在于水果和蔬菜中，對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化有較強(qiáng)的保護(hù)作用。CAPE和EFE都含有α, β-不飽和酮結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)ARE的能力與姜黃素的效果相當(dāng)[15]。

查爾酮是一類存在于多種植物中的開(kāi)鏈黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)主鏈由兩個(gè)苯環(huán)通過(guò)3個(gè)碳原子的α, β-不飽和羰基連接。查耳酮具有許多生物學(xué)性質(zhì)，如抗增殖、抗炎和抗感染活性。兩個(gè)典型的查耳酮化合物索法酮和異甘草素可以通過(guò)激活Keap1-Nrf2-ARE途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá)。索法酮是中藥苦參中廣豆根酮的衍生物，異甘草素存在于光果甘草的根中。一些天然存在的香豆素衍生物，如歐前胡素和橙皮油素，都具有經(jīng)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路誘導(dǎo)ARE相關(guān)酶活性的作用。

黃酮廣泛存在于果蔬及茶等人們?nèi)粘５娘嬍持?，其在結(jié)構(gòu)上含有α, β-不飽和酮。許多黃酮具有誘導(dǎo)ARE的特性，這些黃酮包括4-溴黃酮和β-萘黃酮，天然異黃酮sappanone A[16]等。

倍半萜烯如異土木香內(nèi)酯，萜類如紫蘇醛和檸檬醛，都含α, β-不飽和香醛，能誘導(dǎo)Nrf2介導(dǎo)解毒酶的表達(dá)。穿心蓮葉中提取的穿心蓮內(nèi)酯具有通過(guò)Keap1-Nrf2-ARE途徑，誘導(dǎo)ARE的作用[17]。

黃腐酚是啤酒花中的特有產(chǎn)物，從生姜中可以分離得到6-脫氫姜二酮，黃腐酚和6-脫氫姜二酮可以通過(guò)促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，激活A(yù)RE系統(tǒng)，其機(jī)制與結(jié)構(gòu)中的α, β-不飽和酮結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

2.3 異硫氰酸酯類天然異硫氰酸酯(isothiocyanates，ITCs)以惰性芥子油苷前體形式大量存在于十字花科蔬菜中，如西蘭花和卷心菜。一旦食入，芥子油苷由胃腸道微生物菌群的作用轉(zhuǎn)化為ITCs。異硫氰酸酯基(-N=C=S)的中心碳原子高度親電，容易與巰基反應(yīng)，形成二硫代氨基甲酸酯。ITCs與Keap1半胱氨酸殘基中的巰基反應(yīng)，被認(rèn)為是破壞Keap1-Nrf2的相互作用和最終誘導(dǎo)ARE基因的機(jī)制。異硫氰酸酯類化合物中，天然異硫氰酸酯萊菔硫烷(isothiocyanates sulforaphane，SFN)和苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate，PEITC)的研究最充分[18]。亞砜硫代氨基甲酸酯(sulfoxythiocarbamate，STCA)保留了誘導(dǎo)ARE活性的結(jié)構(gòu)特征。STCA類似物的親電性遠(yuǎn)高于萊菔硫烷，異硫氰酸酯與巰基可形成可逆的結(jié)合物，而STCA與巰基的反應(yīng)是不可逆的。

2.4 二硫醚和二烯丙基硫化物二硫醚是一種具有抗癌及細(xì)胞保護(hù)作用的五元環(huán)狀含硫化合物。3H-1,2-二硫-3-硫酮(D3T)是最簡(jiǎn)單的二硫醚化合物，可從十字花科蔬菜(如卷心菜、甘藍(lán))中提取得到，它五元環(huán)內(nèi)的二硫鍵可與巰基反應(yīng)。D3T的異構(gòu)體1,3-二硫-2-硫酮在高濃度下無(wú)上述效果，表明1, 2-二硫化物結(jié)構(gòu)的重要性。烯丙基硫化物是一類在蔥屬蔬菜(如大蒜、洋蔥)中發(fā)現(xiàn)的有機(jī)硫化合物，具有抑制多種癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。一些親脂性硫醚，如二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)具有上調(diào)解毒酶表達(dá)的作用，活性強(qiáng)度順序?yàn)镈ATS> DADS> DAS，但是潛在誘導(dǎo)ARE活性的機(jī)制還知之甚少[19]。

2.5 鄰二硫醇類鄰二硫醇可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成親電性質(zhì)的二硫鍵。研究表明，1,2-乙二硫醇[1]和2,3-二巰基琥珀酸[16]可以激活Nrf2。另一種二硫醇的變體(R)-硫辛酸或α-硫辛酸幾乎存在于所有的食品中，且在菠菜和花椰菜中的含量略多于其他食物，可通過(guò)內(nèi)源性生成。(R)-硫辛酸是一種分子營(yíng)養(yǎng)素和抗氧化劑，現(xiàn)已證明，它能通過(guò)激活Nrf2誘導(dǎo)各種抗氧化酶的表達(dá)[20]。

2.6 三價(jià)砷類化合物砷(Ⅲ)對(duì)硫醇較高的親和性被認(rèn)為是急性和慢性砷化合物中毒的起因之一。但研究表明，低劑量的砷可降低癌癥的發(fā)病率。砷類化合物，如亞砷酸鈉、三氧化二砷(ATO)和單甲基砷酸(MMA)可調(diào)節(jié)Keap1-Cul3 E3泛素連接酶復(fù)合物，以激活Nrf2。雙砷硫醇標(biāo)記的熒光素試劑(FLASH-EDT2)和氧化苯砷(PAO)也可激活依賴Keap1的Nrf2[21]。

2.7 含硒化合物硫和硒具有類似的負(fù)電性，各種有機(jī)硒化合物具有細(xì)胞保護(hù)活性。蘿卜硫素的硒異位體化合物SFN-isoSe對(duì)Nrf2的誘導(dǎo)活性比蘿卜硫素(SFN)更為優(yōu)異。依布硒啉是一種有效的多功能抗氧化劑和抗炎劑，能調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2介導(dǎo)的解毒酶基因的表達(dá)[22]。有機(jī)硒化合物3-selena-1-dethiacephem也是Nrf2-ARE的活化劑和ROS的直接清除劑。

2.8 氫過(guò)氧化物當(dāng)機(jī)體內(nèi)生成的自由基和過(guò)氧化物超出了生物系統(tǒng)的清除或修復(fù)能力時(shí)，將會(huì)誘發(fā)氧化應(yīng)激。過(guò)氧化物的O—O鍵可以很容易破裂并釋放氧自由基，進(jìn)而與巰基反應(yīng)，以形成磺酸酯(RSO-)。含量較低的過(guò)氧化氫和有機(jī)過(guò)氧化物，如叔丁基過(guò)氧化氫可以通過(guò)氧化Keap1的巰基，作為誘導(dǎo)劑，激活依賴Nrf2及ARE的基因[23]。

2.9 多烯類多烯類化合物包含1個(gè)或多個(gè)序列交替的不飽和單雙碳-碳鍵。由于不飽和程度高，這些化合物較易通過(guò)生物轉(zhuǎn)化為親電子代謝物，可與游離巰基反應(yīng)。類胡蘿卜素是一類多烯化合物，具有癌癥預(yù)防作用，類胡蘿卜素可以激活A(yù)RE轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，并誘導(dǎo)抗氧化和細(xì)胞保護(hù)酶的表達(dá)。番茄紅素是一種主要存在于番茄中的紅色類胡蘿卜素色素，番茄紅素及其潛在的氧化代謝產(chǎn)物10,10’-diapocarotene-10,10’-dial包含邁克爾受體基團(tuán)，可以共價(jià)修飾Keap1，活化Nrf2，并提高ARE介導(dǎo)基因的表達(dá)[24]。

2.10 重金屬和金屬配合人類生存需要微量的重金屬，如鐵、鈷、銅和鋅，但過(guò)量的重金屬是有危害的，一些重金屬如汞、鎘、金、鉛有劇毒。部分重金屬(如汞、鎘、鋅)可以誘導(dǎo)ARE基因的表達(dá)。氯化鎘是一種已知的人體致癌物，它能通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)癌癥，這些機(jī)制包括誘導(dǎo)異常的基因表達(dá)、抑制DNA損傷修復(fù)、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡。鎘具有誘導(dǎo)ARE基因表達(dá)的能力，這可以看作是一種生物防御機(jī)制，以對(duì)抗鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的影響[25]。金諾芬(Auranofin)是一個(gè)含金的抗風(fēng)濕藥物，它也可以通過(guò)激活Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用。

3 總結(jié)與展望

Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)抗氧化防御機(jī)制非常重要，它可以激活細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)各種氧化應(yīng)激損傷。Keap1是Nrf2的負(fù)性調(diào)節(jié)器，Nrf2是ARE系統(tǒng)的主要效應(yīng)器。通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)Keap1蛋白激活A(yù)RE系統(tǒng)可以誘導(dǎo)一系列抗氧化基因的表達(dá)，這對(duì)預(yù)防氧化損傷、炎癥和腫瘤的發(fā)生非常關(guān)鍵。因此，激活Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)，對(duì)開(kāi)發(fā)抗氧化、抗炎和抗癌藥物具有很大價(jià)值。在過(guò)去的幾十年中，許多Nrf2的激活劑已經(jīng)被開(kāi)發(fā)，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。而且在體外和體內(nèi)由遺傳或化學(xué)試劑誘導(dǎo)二相代謝酶基因表達(dá)增高，都可以起到細(xì)胞保護(hù)的作用。目前，一些天然及合成的小分子已被認(rèn)定為ARE系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑，如蘿卜硫素、甲基多巴索隆、奧替普拉和依布硒林，這些藥物目前已用于多種病癥的臨床試驗(yàn)，如乳腺癌、前列腺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、慢性腎臟病、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病等。大多數(shù)已知的Keap1抑制劑具有親電性的共同特征，修飾和改變Keap1上的半胱氨酸巰基，可以活化ARE。Keap1-Nrf2的連接處已經(jīng)演變?yōu)橹苯踊罨涂赡嬲T導(dǎo)ARE的分子靶點(diǎn)，這為尋找及研究Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活劑提供了研究方向。