蒺藜配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚娜，黃燕明，陳桂生，李雪銀，康志英

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300)

蒺藜配方顆粒是以蒺藜飲片為原料，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒和包裝等工藝制備而成。原料蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果實。秋季果實成熟時采割植株，曬干，打下果實，除去雜質(zhì)。具有平肝解郁、活血祛風、明目止癢的功效。臨床上用于頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳癰、目赤翳障和風疹瘙癢等[1-2]。蒺藜中的化學成分研究已有報道，主要含有皂苷類、黃酮類、生物堿、多糖類、甾醇類、氨基酸類、萜類、脂肪酸和無機鹽等化合物[3-5]。研究表明，蒺藜具有抗衰老、降血糖、降血脂、性強壯及提高人體中性激素含量等作用，對腫瘤、高血壓、細菌真菌感染和糖尿病等均有較好療效[6-8]。

中藥指紋圖譜[9-13]具有全息性、客觀性、準確性、整體性和模糊性的特征，能較好地表征中藥化學物質(zhì)組成的完成性及復雜性，能全面地反映中藥中的化學成分信息，被廣泛運用到中藥和天然藥物質(zhì)量評價中,高效液相指紋圖譜是應用最廣的技術手段之一。目前國內(nèi)尚無關于蒺藜配方顆粒指紋圖譜研究的文獻報道，國家亦未出臺該中藥配方顆粒國家標準。本實驗采用HPLC-DAD法對蒺藜配方顆粒進行指紋圖譜研究，結(jié)果該方法穩(wěn)定、重復性好，可為蒺藜配方顆粒質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

十萬分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate3000 DIONEX高效液相色譜儀；Agilent 1200高效液相色譜儀。

蒺藜對照藥材(中國食品藥品檢定研究所，121296-701105，規(guī)格：3 g)；乙腈、冰醋酸(色譜級)；甲醇、正丁醇(分析純)。

10批蒺藜配方顆粒均來自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號依次為01～10，規(guī)格均為1.0 g/袋)；麥芽糊精(湖州展望藥業(yè)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長為25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動相A，0.5%冰醋酸溶液為流動相B，按表1中的條件進行梯度洗脫；檢測波長為320 nm；柱溫30 ℃。結(jié)果見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2 參照物溶液的制備

取蒺藜對照藥材3 g，精密稱定，加水30 mL，回流提取1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取蒺藜配方顆粒約1 g，研細，精密稱定，置錐形瓶中，加入1 g硅藻土，研磨混勻，精密加入水飽和正丁醇25 mL，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，過濾，濾液蒸干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，濾過，即得。

2.4 測定法

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。

2.5 10批樣品的檢測結(jié)果

分別取10批蒺藜配方顆粒，按“2.3”項下方法制備10份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，得到10批蒺藜配方顆粒的色譜疊加圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.1版)對10批蒺藜配方顆粒指紋圖譜進行計算，相似度達0.999以上。結(jié)果見圖1～2和表2。

圖1 10批蒺藜配方顆粒HPLC特征圖譜疊加

2.6 指紋圖譜中共有峰的確認

通過對10批蒺藜配方顆粒的HPLC指紋圖進行分析，有10個色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故初步確立10個共有峰。經(jīng)與蒺藜對照藥材進行比對，2、3、4、5、6、9及10號共有峰的保留時間及紫外光譜與蒺藜對照藥材均吻合。李瑞海[8]指出蒺藜的水溶性成分主要是黃酮、皂苷類，并對菝葜皂苷元進行了紫外光譜掃描，其圖譜與上述共有峰的紫外光譜相似。故推測其為菝葜皂苷類成分，且其峰面積均大于總峰面積的3%，因此擬立2、3、4、5、6、9及10號共有峰為特征峰1～7號。

2.7 指紋圖譜方法學考察

2.7.1 專屬性試驗

取蒺藜配方顆粒、麥芽糊精及蒺藜對照藥材分別按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件測定，見圖3，結(jié)果表明，7個共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專屬性。

圖2 蒺藜配方顆粒HPLC指紋圖譜共有模式

批號12345678910對照指紋圖譜011.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000021.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000031.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000041.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000051.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000061.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000071.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000080.9990.9990.9990.9991.0000.9990.9991.0001.0000.9990.999091.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000101.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000對照指紋圖譜1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.9991.0001.0001.000

注：A:蒺藜對照藥材;B:陰性對照;C:空白溶劑;D:蒺藜配方顆粒。圖3 蒺藜配方顆粒HPLC指紋圖譜專屬性試驗

2.7.2 精密度試驗

取同一批蒺藜配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012.1版)進行相似度評價，各圖譜共有峰與對照指紋圖相似度均達1.000，表明該儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗

取同一批蒺藜配方顆粒樣品，平行6份，按“2.3”項下方法制備，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，各圖譜特征峰的相似度為1.000，表明該方法重復性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗

取同一份蒺藜配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24和48 h進樣，記錄色譜圖，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均為1.000，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 中間精密度試驗

分別考察不同分析人員、不同日期和不同設備對精密度的影響，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均達0.998以上，表明該方法中間精密度良好，隨機變動因素不影響該方法精密度。

2.7.6 耐用性實驗

取同一批蒺藜配方顆粒供試品，按“2.3”項下方法處理樣品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)、Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號的色譜柱，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，結(jié)果在不同色譜柱因素變動的條件下，各圖譜共有峰的相似度均達0.994以上，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本實驗對不同實驗條件進行優(yōu)化，考察了乙腈-0.5%磷酸溶液，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.5%冰醋酸溶液，乙腈-水等流動相體系；不同的柱溫；全波長掃描考察了不同波長下供試品的指紋圖譜。最終選取在柱溫為30 ℃，檢測波長為320 nm，以乙腈-0.5%冰醋酸溶液梯度洗脫，該條件下譜圖色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性好。

在色譜柱的選擇中，根據(jù)蒺藜配方顆粒樣品中的成分類別及理化性質(zhì)，選用C18柱進行分離，分別考察了Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)三種型號的色譜柱，各色譜峰均能達到基本分離，各型號色譜柱分離效果符合要求。

通過相似度計算軟件得到10批蒺藜配方顆粒的對照圖譜及各批樣品與對照圖譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.99，表面各批次樣品之間相關性較好，投料所用的蒺藜原藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，蒺藜配方顆粒工藝穩(wěn)定。

綜上所述，本實驗中建立的采用HPLC檢測蒺藜配方顆粒指紋圖譜方法穩(wěn)定性、重復性好，可為蒺藜配方顆粒質(zhì)量控制和評價提供參考。