鐵皮石斛粉對(duì)SD大鼠致畸作用研究

劉泳廷，高敏，劉佳，鄭沖，劉玲，葉建方，苑潔

(貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科石斛屬多年生草本植物，別名黑節(jié)草、鐵吊蘭，是石斛屬植物中藥用價(jià)值最高的一種石斛。以新鮮或干燥的莖入藥，作為滋陰清熱、益胃生津潤(rùn)肺的傳統(tǒng)中藥，具有悠久的食用和使用方面的歷史[1-3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鐵皮石斛的化學(xué)成分、藥理活性和質(zhì)量控制方法均開(kāi)展了大量的研究。研究表明,鐵皮石斛的成分主要為多糖和生物堿，含有少量的糖苷、菲類、聯(lián)芐類和氨基酸等[4-5]，具有抗衰老、抗腫瘤、降低血糖、提高免疫功能等作用，對(duì)惡性腫瘤、胃腸道疾病、糖尿病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎、血栓閉塞性脈管炎及慢性咽炎等有很好的療效，治療和保健意義非常重大[6-12]。但目前有關(guān)鐵皮石斛及其同類產(chǎn)品毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)研究的資料少見(jiàn)報(bào)道，且未見(jiàn)生殖毒性及致畸作用的相關(guān)研究報(bào)道。貴州由于優(yōu)越的地理位置及良好的生態(tài)環(huán)境,境內(nèi)曾擁有豐富的野生鐵皮石斛資源,是鐵皮石斛的原產(chǎn)地之一[13-14]。本次研究擬對(duì)貴州產(chǎn)鐵皮石斛粉致畸作用進(jìn)行試驗(yàn)研究，旨在了解鐵皮石斛粉對(duì)SD大鼠是否具有胚胎毒性和致畸毒性。

1 材料與方法

1.1 受試物

鐵皮石斛粉為淺黃綠色粉末，由貴州某藥業(yè)公司提供。人體口服推薦量為每日1.5 g。

1.2 對(duì)照藥物

阿司匹林(規(guī)格：100 mg，批號(hào)：160528，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；陰性對(duì)照為蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境

SPF級(jí)健康成年SD大鼠，雌性120只(體質(zhì)量230～260 g)，雄性60只(體質(zhì)量300～330 g)，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供：SCXK(黔)2018-0001。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1202129。實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境動(dòng)物使用許可證：SYXK(黔)2014-001。溫度：20℃～26℃,濕度：40%～70%。SPF級(jí)繁殖飼料由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供：SCXK(川)2015-01。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 分組與處理

實(shí)驗(yàn)共分5組，陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組及3個(gè)劑量組。按最大灌胃量法給予樣品，劑量設(shè)計(jì)如下：鐵皮石斛粉0.63 g/kgBW、1.25 g/kgBW和2.50 g/kgBW，相當(dāng)于人體推薦攝入量的25倍、50倍和100倍，陰性對(duì)照組為蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組為阿司匹林(250 mg/kgBW)。低、中、高劑量組受試物配制為分別稱取樣品6.3 g、12.5 g、25.0 g加蒸餾水定容到150 mL；陽(yáng)性對(duì)照組配制為稱取阿司匹林2.5 g加蒸餾水定容到150 mL。每日即配即用，各組灌胃量均為15 mL/kgBW，每天1次。

1.4.2 方法

SD大鼠雌、雄按1:1合籠過(guò)夜后，每日早晨觀察陰栓，查出陰栓認(rèn)為該鼠已交配，當(dāng)日作為“受孕”零天。確認(rèn)的“孕鼠”隨機(jī)分到各組，每組20只，并稱重、編號(hào)，在受孕的第6～15天，各組每天經(jīng)口給予受試物(灌胃體積15 mL/kgBW)。在0、6、9、12、15和20天分別稱體質(zhì)量一次，按體質(zhì)量調(diào)整受試物灌胃量，并予記錄，自由進(jìn)食飼料。第20天頸椎脫臼處死母體，剖腹取出子宮，稱子宮連胎重，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)，逐一記錄胎鼠性別、體重、體長(zhǎng)、胎盤重及外觀有無(wú)畸形。每窩1/2活胎放入95%的乙醇中固定后放入10 g/L的氫氧化鉀溶液內(nèi)，透明后放入茜素紅應(yīng)用液中染色，在體視顯微鏡下檢查有無(wú)骨骼畸形。另1/2活胎放入Bouins液固定2周后作內(nèi)臟檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS18 FORWINDOWS統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量指標(biāo)的組間差異采用方差分析，計(jì)數(shù)指標(biāo)的組間差異采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)孕鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

在整個(gè)試驗(yàn)期間，各組孕鼠均未見(jiàn)異常癥狀和體征，也無(wú)死亡。陰性對(duì)照組孕鼠在整個(gè)妊娠期體質(zhì)量增長(zhǎng)正常。鐵皮石斛粉低、中、高劑量組各時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量增長(zhǎng)正常，與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組孕鼠在妊娠第12天體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢，顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 鐵皮石斛粉對(duì)孕鼠體質(zhì)量的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 對(duì)孕鼠胚胎發(fā)育的影響

陰性對(duì)照組子宮連胎重、黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)和胎鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、胎盤重等均正常。鐵皮石斛粉低、中、高劑量組平均活胎體質(zhì)量、平均活胎體長(zhǎng)、平均胎盤重與陰性對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但無(wú)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，且均在本實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)數(shù)據(jù)正常范圍內(nèi)，其余指標(biāo)與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組吸收胎率顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)；子宮連胎重、平均活胎體重、平均活胎體長(zhǎng)均顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明阿司匹林有明顯的胚胎毒性。各劑量組均未出現(xiàn)死胎，外觀檢查僅陽(yáng)性對(duì)照組有3只胎鼠腦膨出合并脊柱裂，外觀畸形率1.50%，見(jiàn)表2和表3。

注：與陰性對(duì)照組比較，**P<0.01。

表3 鐵皮石斛粉對(duì)活胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 對(duì)胎鼠骨骼的影響

鐵皮石斛粉各劑量組胎鼠骨骼改變主要為胸骨缺失、胸骨骨化不全、14對(duì)肋和短肋，與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明鐵皮石斛粉對(duì)胎鼠骨骼分化無(wú)不良影響。陽(yáng)性對(duì)照組胎鼠骨骼畸形主要為頭骨骨化異常、脊椎椎體分岔、椎體單側(cè)骨化、頸椎間隙增寬、15對(duì)肋、胸骨缺失，畸形率高達(dá)98.95%，顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表4、圖1。

表4 鐵皮石斛粉對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育的影響

注：與陰性對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.4 對(duì)胎鼠內(nèi)臟的影響

鐵皮石斛粉低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)有內(nèi)臟畸形；陽(yáng)性對(duì)照組見(jiàn)內(nèi)臟異常胎鼠數(shù)13只，主要為臟器淤血，并見(jiàn)側(cè)腦室擴(kuò)張2只、腎盂擴(kuò)張2只、腎偏小1只，內(nèi)臟畸形率12.38%，顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表5。

3 討論

致畸作用是發(fā)育毒性中最主要的一種表現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)妊娠動(dòng)物接觸受試物后引起的致畸可能性，可預(yù)測(cè)其對(duì)人體可能的致畸性，是衡量外來(lái)化合物發(fā)育毒性的重要指標(biāo)。母體在孕期受到可通過(guò)胎盤屏障的有害物質(zhì)的作用，會(huì)影響胚胎的器官分化與發(fā)育，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異常，出現(xiàn)胎鼠畸形。因此，在受孕動(dòng)物的胚胎著床后，器官形成期給予受試物，可檢出該物質(zhì)對(duì)胎鼠的致畸作用。本次研究用鐵皮石斛粉在孕鼠的致畸敏感期進(jìn)行染毒，不但能檢測(cè)鐵皮石斛粉的致畸性，還可以觀察其致胚胎、胎鼠死亡和生長(zhǎng)遲緩等資料。

注：①⑤陰性對(duì)照組；②③④⑦⑧陽(yáng)性對(duì)照組(箭頭所示分別為②囟門偏大，③枕骨Ⅰ級(jí)，④囟門偏大、枕骨骨化不全,⑦雙側(cè)波形肋，⑧第14胸椎椎體單側(cè)骨化，第11、12胸椎椎體分岔)；⑥鐵皮石斛高劑量組：雙側(cè)短肋。圖1 體視顯微鏡下觀察阿司匹林和鐵皮石斛粉對(duì)胎鼠骨骼發(fā)育的影響

組別受檢胎鼠數(shù)頭部胸部腹部?jī)?nèi)臟畸胎數(shù)內(nèi)臟畸形率(%)腦/腦室出血圍腦膜下出血側(cè)腦室擴(kuò)張小眼/無(wú)眼胸腔淤血肺偏小腹腔淤血肝淤血腎臟偏小腎盂擴(kuò)張陰性對(duì)照組124000000000000.00低劑量組116000000000000.00中劑量組113000000000000.00高劑量組118000000000000.00陽(yáng)性對(duì)照組10521203021121312.38**

注：與陰性對(duì)照組比較，**P<0.01。

本次研究中，設(shè)定的陽(yáng)性對(duì)照物為阿司匹林，劑量250 mg/kgBW，實(shí)驗(yàn)孕鼠呈現(xiàn)明顯的胚胎毒性和致畸胎作用，其中子宮連胎重、平均活胎體質(zhì)量、平均活胎體長(zhǎng)均顯著低于陰性對(duì)照組，外觀檢查有3只胎鼠見(jiàn)腦膨出合并脊柱裂，吸收胎率9.91%，骨骼畸形率98.95%，內(nèi)臟畸形率12.38%，均顯著高于陰性對(duì)照組，這與本實(shí)驗(yàn)室以往設(shè)立的陽(yáng)性對(duì)照模型結(jié)果相吻合，提示本次研究所選SD大鼠種屬對(duì)致畸物反應(yīng)敏感。

本次研究采用最大灌胃量法設(shè)計(jì)給予受試物，因鐵皮石斛粉為一種易吸水、黏稠度高的物質(zhì)，故設(shè)計(jì)的最高劑量為2.5 g/kgBW，達(dá)到每日人體推薦劑量的100倍。實(shí)驗(yàn)期間未見(jiàn)孕鼠進(jìn)食量減少及其他母體中毒癥狀，鐵皮石斛粉各劑量組孕鼠增重、黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)和死胎數(shù)未見(jiàn)異常，對(duì)胎鼠體質(zhì)量、胎盤重、身長(zhǎng)、骨骼和內(nèi)臟也未見(jiàn)明顯影響。鐵皮石斛粉在達(dá)到人體推薦量100倍的劑量對(duì)大鼠未顯示明顯的母體毒性、胚胎毒性和致畸性，致畸毒性的無(wú)明顯有害作用水平為2.5 g/kgBW，提示鐵皮石斛粉對(duì)人體可能無(wú)明顯的致畸作用。本次研究為鐵皮石斛作為藥物、保健食品、新食品資源的開(kāi)發(fā)利用提供了生殖毒理學(xué)參考依據(jù)。