外源激素浸種對(duì)大麻種子萌發(fā)、生殖生長(zhǎng)及四氫大麻酚的影響

吳姍，程超華，粟建光，鄧燦輝，唐蜻，戴志剛，楊澤茂，許英，劉嬋

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長(zhǎng)沙410205）

激素是植物體內(nèi)的微量信號(hào)分子，植物組織對(duì)不同激素及其不同濃度的敏感性控制了植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程［1]。激素是植物體內(nèi)一種重要的內(nèi)源性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育有不可忽略的影響［2]。外源激素的使用可以調(diào)控內(nèi)源激素的水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程［3]，如Duan等［4]研究發(fā)現(xiàn)，外源GA3和6-BA能夠促進(jìn)狹葉紫椎菊種子提前萌發(fā)，影響種子的生理和代謝活動(dòng)。在農(nóng)業(yè)上，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用于農(nóng)作物以達(dá)到增產(chǎn)的目的，近年來也常用來作用于藥用植物以提高其有效成分的含量，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益或滿足社會(huì)需求。如不同濃度的矮壯素（CCC）均能顯著提高黃花蒿青蒿素、青蒿乙素含量［5]；在紅豆杉培養(yǎng)過程中加入茉莉酸甲酯，紫杉醇含量提高15倍，當(dāng)茉莉酸甲酯與乙烯利共同作用時(shí)紫杉醇含量提高19倍［6]。

大麻（Cannabis sativaL.）是大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（Cannabis）一年生草本植物，多為雌雄異株，偶有雌雄同株［7]，起源于中國(guó)，是最古老的傳統(tǒng)農(nóng)作物之一。研究表明，大麻的生長(zhǎng)發(fā)育與外界環(huán)境有密切的關(guān)系，大麻花葉產(chǎn)量受光照時(shí)間［8]、紫外線強(qiáng)度［9]、環(huán)境溫度［10]、土壤肥料［11]、病蟲感染［12]等多種環(huán)境因子的影響。另外，植物外源激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響重大，已被廣泛應(yīng)用于研究。因此，本試驗(yàn)擬用植物激素進(jìn)行浸種處理以研究其對(duì)大麻生長(zhǎng)發(fā)育的影響，期望為激素調(diào)控大麻生長(zhǎng)發(fā)育過程提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所選大麻為原產(chǎn)黑龍江地區(qū)的地方品種，編號(hào)DMG233，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所麻類種質(zhì)資源課題組提供。

1.2 試劑

乙烯利（Ethrel，ETH）、赤霉素（Gibberellin，GA3）、激動(dòng)素（Kinetin，KT）和吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾克賽侖生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明:激素浸種時(shí)間對(duì)大麻種子發(fā)芽率有很大的影響，且不同激素不同濃度處理對(duì)種子發(fā)芽率影響不同。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置激素濃度和浸種時(shí)間，見表1。

表1 不同激素處理時(shí)間和濃度Table 1 Different hormone treatment time and concentration

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，8月2日挑選籽粒飽滿健壯的種子浸泡14 h后分別用KT（1、5、10 mg/L）和IAA（10、50、100 mg/L）浸種1 h，ETH（1、50、100mg/L）和 GA3（10、50、100mg/L）浸種3 h。以蒸餾水浸泡1 h和3 h的種子作為對(duì)照組，共14個(gè)處理。試劑以浸沒種子為宜，期間不做任何處理。處理結(jié)束后采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)將種子種植于穴盤中，置于室內(nèi)（苗期光18 h/6 h）條件下，晝夜溫度為（24±2）℃，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30粒種子。分別于種植7日和10日后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率，幼苗高約25 cm時(shí)將其移栽至直徑30 cm×40 cm的圓底盆中（進(jìn)口土與珍珠巖體積比為3∶1），每個(gè)處理6盆，每盆6～8株不等，2盆一個(gè)重復(fù)，置于室外（光照約為12 h/12 h），每周定期澆水施肥。

1.4 觀察與數(shù)據(jù)收集

1.4.1 種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)計(jì)算

播種7日后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢(shì)，即種子發(fā)芽的整齊度；播種10日后統(tǒng)計(jì)不同激素處理的種子發(fā)芽率。計(jì)算方法如下:

種子發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽種子數(shù)÷播種總數(shù)）×100%

種子發(fā)芽勢(shì)（%）=（規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)÷播種總數(shù)）×100%1.4.2 生殖生長(zhǎng)調(diào)查

（1）花芽分化:觀察記錄不同激素處理?xiàng)l件下，每盆植株的現(xiàn)蕾開花時(shí)間及雌花序長(zhǎng)度（取平均值以減少差異）。

（2）性別分化:觀察記錄不同激素處理?xiàng)l件下，植株的雌雄比例以及雌雄同株現(xiàn)象。

1.4.3 THC含量測(cè)定

樣品取樣后在室溫下黑暗干燥，完全干燥后進(jìn)行研磨；然后準(zhǔn)確稱量研磨充分均勻的樣品（0.2000±0.0020 g）置于含有4 mL甲醇的10 mL離心管中；超聲處理10 min（溫度29℃，水位顯示10 cm，功率100%）；靜置1 h后離心5min；取上清液用甲醇定容至10mL；使用注射器通過0.45 um的有機(jī)濾膜過濾注入液相瓶1.0～1.5 mL［13]。

HPLC分析在安捷倫模塊化模型1260系統(tǒng)上進(jìn)行，該系統(tǒng)由TCC、四元泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）四部分組成。恒溫色譜柱為ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm i.d.，5μm，Agilent，USA）。流動(dòng)相組成為0.1%乙酸水（A）和乙腈（B）。流速0.800 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10.00 uL。

1.4.4 HMGR和DXS活性測(cè)定

植物中的萜烯生物合成經(jīng)歷了胞質(zhì)溶膠中的甲羥戊酸（MVA）途徑和質(zhì)體中的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸/2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（DOX/MEP）途徑［14]。大麻植物中大麻素的產(chǎn)生和積累遵循非甲羥戊酸途徑［15]。由于HMGR（3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶）是植物中甲羥戊酸途徑的重要控制點(diǎn)［16]，DXS（1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶）對(duì)植物中產(chǎn)生2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸衍生的類異戊二烯有調(diào)節(jié)作用［17]，故該兩種酶在大麻素合成中可能起重要作用。

使用Russell［18]的方法分離粗制酶提取物并加以改進(jìn)。轉(zhuǎn)室外兩個(gè)月后挑選生長(zhǎng)基本一致的6～8株植株頂端第3或第4葉片，混合后準(zhǔn)確稱鮮重（0.2000±0.0020）g后將樣品于液氮條件下在研磨機(jī)上研磨并保存于-80℃，3個(gè)重復(fù)。按1∶9（g/mL）的比例加入勻漿介質(zhì)于離心管中，將制備好的10%勻漿液在5000 r/min條件下離心15 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定過程嚴(yán)格按照試劑盒上說明進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21和EXCEL進(jìn)行整理和分析，所有數(shù)據(jù)均以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素浸種對(duì)大麻種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

由表2可知，經(jīng)過不同種類、不同濃度的激素處理后，大麻種子的發(fā)芽率均有一定程度的降低。KT和GA3激素處理?xiàng)l件下，隨著激素濃度的提高，發(fā)芽率顯著降低；而IAA處理卻沒有顯著變化，3個(gè)濃度梯度（10、50、100 mg/L）的發(fā)芽率分別為88%、86%、88%，與對(duì)照相比均沒有顯著差異；ETH激素處理?xiàng)l件下，發(fā)芽率在3個(gè)濃度條件下（1、50、100 mg/L）也沒有顯著差異。產(chǎn)生這種差異的原因可能是由于不同激素對(duì)種子的影響不同，也可能是種子自身的活力不同所致。

表2 不同種類和不同濃度激素浸種對(duì)大麻種子發(fā)芽率的影響Table 2 Effect of seed soaking with different hormones on germination rate of hemp seeds

續(xù)表2

由表3可知，KT和GA3浸種處理，發(fā)芽勢(shì)隨著濃度的升高而降低，并且部分處理濃度下表現(xiàn)出顯著差異；IAA和ETH激素處理，發(fā)芽勢(shì)沒有顯著差異。產(chǎn)生這種差異可能是由于種子自身的活力不同，也可能是不同激素對(duì)種子影響不同。

表3 不同種類和不同濃度激素浸種對(duì)大麻種子發(fā)芽勢(shì)的影響Table 3 Effects of seed soaking with different hormones on germination potential of hemp seeds

2.2 外源激素浸種對(duì)大麻性別和花器官發(fā)育的影響

從表4可以看出，4種外源激素浸種處理對(duì)大麻植株開花時(shí)間、雌花序長(zhǎng)度及雌雄比例的影響均不同，雌花序長(zhǎng)度與對(duì)照相比差異不顯著，植株的開花時(shí)間和雌雄比例有部分表現(xiàn)出顯著差異。50、100 mg/L的ETH和GA3都較明顯地提高了大麻植株的雌雄株比例，其中100 mg/L ETH條件下最顯著，與對(duì)照相比提高了68.82%，雌雄比例達(dá)到1.57∶1。

表4 不同種類和不同濃度激素浸種對(duì)大麻生殖生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of seed soaking with different hormones on the reproductive growth of hemp

2.3 外源激素浸種對(duì)大麻葉片中THC含量的影響

因THC具有致幻成癮性，在我國(guó)生產(chǎn)上要求工業(yè)大麻THC含量在0.3%以下。由圖1可知，THC含量符合規(guī)定。分析可知，1、10 mg/L的KT處理，可顯著提高THC的含量，其他條件均不同程度地降低了THC的含量。其中ETH與GA3處理THC含量與對(duì)照相比均顯著降低，高濃度的ETH處理降低更顯著。在100 mg/L ETH條件下，THC含量降低了89.09%，降至0.006%。在其他濃度處理下THC含量有不同程度的降低，但均未達(dá)到顯著差異。故結(jié)合THC含量，ETH與GA3在3個(gè)濃度梯度下處理對(duì)實(shí)際生產(chǎn)均有一定的利用價(jià)值。

圖1 不同種類與不同濃度激素浸種對(duì)大麻葉片中THC含量的影響Fig.1 Effects of different hormones soaking on THC content in hemp leaves

2.4 外源激素浸種對(duì)大麻葉片中HMGR和DXS活性的影響

由表5可知，低濃度（1 mg/L）KT處理?xiàng)l件下，HMGR活性（101.20 IU/L）與對(duì)照相比增加了18.61%，達(dá)到顯著差異；IAA浸種處理與對(duì)照相比，在低濃度（10 mg/L）和高濃度（100 mg/L）下HMGR活性均顯著提高，分別達(dá)到107.53 IU/L和107.64 IU/L；ETH浸種處理在3個(gè)濃度條件下HMGR和DXS活性均沒有表現(xiàn)出顯著差異；50 mg/L的GA3處理顯著降低了DXS的活性，為188.23 IU/L（降低25.56%）。結(jié)果表明:4種激素處理對(duì)酶活性的影響沒有一定規(guī)律可循，與THC含量也沒有顯著相關(guān)性?？赡苁怯捎诖舐樗氐暮铣墒且粋€(gè)非常復(fù)雜的過程，激素的處理具體作用于哪一步驟還有待進(jìn)一步研究。

表5 不同種類和不同濃度激素浸種對(duì)HMGR和DXS酶活性的影響Table 5 Effects of seed soaking with different hormones on the activity of HMGR and DXS enzymes

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同種類、不同濃度的外源激素浸種對(duì)大麻種子的萌發(fā)、雌雄比例、葉片中THC含量及酶活性有不同的影響。GA3、IAA浸種對(duì)發(fā)芽率的影響與何興佳［19]對(duì)西葫蘆、陳梅［20]對(duì)蓖麻種子的研究結(jié)果基本一致；ETH浸種處理與賀軍民［21]對(duì)貫葉連翹種子的研究結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)生可能是由于種子對(duì)不同激素的響應(yīng)機(jī)制不同，也可能是供試種子自身活力不同所致。另外，ETH浸種對(duì)大麻性別的影響與朱麗華［22]對(duì)迷你桔、Ram［23]對(duì)大麻、Papadopoulou［24]對(duì)甜瓜的研究結(jié)果一致，均有顯著的促雌性；GA3浸種對(duì)促雌性的影響與汪俏梅［25]對(duì)苦瓜的研究結(jié)果一致；而IAA浸種對(duì)性別分化的影響與強(qiáng)曉霞［26]對(duì)大麻的研究結(jié)果卻不同。究其原因，可能是處理時(shí)期與處理方式不同所致，植物性器官的分化與胚后的生長(zhǎng)發(fā)育過程有關(guān)，性別易受外界條件的影響而改變，有時(shí)外界條件甚至可以使性別發(fā)生逆轉(zhuǎn)。而大麻的生長(zhǎng)發(fā)育及性別與光照密不可分，光照時(shí)間的長(zhǎng)短控制著大麻植株的生長(zhǎng)狀態(tài)，也可能此條件改變了植物體內(nèi)光敏感相關(guān)的生長(zhǎng)機(jī)制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，ETH和GA3處理可顯著降低大麻中THC的含量，且ETH處理各濃度下種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、雌花序長(zhǎng)度和始花期等與對(duì)照相比均沒有表現(xiàn)出顯著差異，即此濃度下浸種處理不會(huì)影響植株的正常生長(zhǎng)，故此處理可在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用以達(dá)到降低THC含量的目的。100 mg/L ETH處理時(shí)，THC含量顯著降低，這一研究結(jié)果與Mansouri H在苗期［27]和花期［28]處理結(jié)果不同，差異的產(chǎn)生可能是由于選擇的大麻品種及植株個(gè)體的差異性，也可能是處理方式及處理時(shí)期不同所致。100 mg/L ETH處理不僅可顯著降低大麻THC含量，還可顯著提高植株的雌雄比例（雌雄比例達(dá)到1.57∶1），與對(duì)照相比提高了68.82%，因此，100 mg/L ETH浸種處理有望應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，但有關(guān)生物學(xué)機(jī)理還需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。