Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒基因密碼子使用偏好性分析

王猛，陳莉，靳旺杰，孫朋輝，王莎莎

(1 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州 510515；2 中山大學(xué)中山眼科中心/眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

脊髓灰質(zhì)炎(簡稱脊灰)是由脊髓灰質(zhì)炎病毒(簡稱脊灰病毒)引起的一種高發(fā)于兒童的急性腸道傳染病，感染脊灰病毒可致患者肢體肌肉出現(xiàn)弛緩性麻痹，并留下終身殘疾，重者可致死亡。脊灰病毒為含有一個(gè)開放閱讀框(ORF)的單股正鏈RNA無包膜病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。VP1是脊灰病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是其主要的抗原決定簇，根據(jù)VP1編碼區(qū)域的不同，脊灰病毒可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三個(gè)基因型[1,2]。隨著消滅脊灰工作的推進(jìn)，人類在與脊灰病毒的戰(zhàn)爭中取得了較大的成就。2017年，僅巴基斯坦和阿富汗有脊灰野毒株的傳播，并報(bào)告病例22例，達(dá)到歷史最低[3]。另外，全球自1999年后未再發(fā)現(xiàn)Ⅱ型脊灰病例，2013年后未再發(fā)現(xiàn)Ⅲ型脊灰野毒株病例，目前流行的脊灰病毒僅為Ⅰ型[4,5]。密碼子是蛋白質(zhì)編碼基因中的基本結(jié)構(gòu)單位，也是生物體遺傳和變異的基本單位。密碼子的使用自認(rèn)知之初就被標(biāo)上偏好性的標(biāo)簽。密碼子使用偏好性無處不在，從病毒到脊椎動(dòng)物均存在不同的密碼子使用偏好模式，而且近緣物種普遍擁有相似的密碼子使用偏好性[6,7]。對密碼子使用偏好性的分析研究，不僅可用于進(jìn)一步掌握物種的遺傳和進(jìn)化信息，并準(zhǔn)確預(yù)測相關(guān)基因功能，而且還可以發(fā)現(xiàn)基因偏好使用的最優(yōu)密碼子[8,9]。本研究對Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 Ⅰ型脊灰病毒毒株基因信息的獲取 從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)檢索并篩選出40條Ⅰ型脊灰病毒株的基因信息，見表1。

1.2 Ⅰ型脊灰病毒基因相對同義密碼子使用度(RSCU)值的計(jì)算 RSCU是指某一特定的密碼子在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對使用概率。RSCU值的計(jì)算方法為某一密碼子所使用的頻率與其在無偏好性使用時(shí)預(yù)期頻率之間的比值，計(jì)算公式見文獻(xiàn)[10]。如果某一密碼子使用模式無偏好性，則RSCU值=1；如果機(jī)體在使用該密碼子時(shí)存在偏好性，則RSCU值≠1;另RSCU值≥1.5表示密碼子使用偏好性較強(qiáng)，RSCU值≤0.5表示密碼子使用偏好性較弱。

1.3 Ⅰ型脊灰病毒基因有效密碼子數(shù)(ENc)計(jì)算 ENc是密碼子使用偏好性的重要參考指標(biāo)，其值在20～61。Wright[11]認(rèn)為，假如一個(gè)基因所有的同義密碼子都是平均使用，則該基因的ENc值趨于61，說明密碼子使用偏好性極弱；反之，同義密碼子之間均偏好使用其中特定的一個(gè)密碼子，則該基因的ENc值趨于20，說明密碼子使用偏好性極強(qiáng)。ENc值35為一重要臨界點(diǎn)，ENc值<35提示密碼子使用偏好性強(qiáng)，ENc值>35提示密碼子使用偏好性弱。本研究中，Ⅰ型脊灰病毒的ENc采用JEMBOSS 1.5軟件包中CHIPS程序計(jì)算得來。

表1 40條Ⅰ型脊灰病毒毒株基因信息

1.4 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性分析 (C+G)3%是指堿基C和G位于第三位的密碼子占所有密碼子的百分比，該數(shù)值通過CodonW軟件計(jì)算得來。之后將獲得的(C+G)3%值與Ⅰ型脊灰病毒的ENc值繪制散點(diǎn)圖，并與(C+G)3%標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較?；蛭挥?C+G)3%標(biāo)準(zhǔn)曲線上或散布在(C+G)3%標(biāo)準(zhǔn)曲線附近時(shí)，說明該基因的密碼子使用模式主要受堿基組成所決定，即密碼子的偏好性受突變壓力影響較大；反之，若基因分布在偏離(C+G)3%標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的位置，則說明其密碼子使用偏好性受自然選擇的影響較大[11,12]。

1.5 不同時(shí)間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性分析 采用主成分分析法(PCA)對Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子的RSCU值進(jìn)行分析，并利用獲得的主因子繪制散點(diǎn)圖，觀察不同時(shí)間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子RSCU值 40株Ⅰ型脊灰病毒毒株基因密碼子的RSCU值見表2。由表2可知，密碼子AGA、AGG、CCA、UCA和GUG的RSCU值均≥1.5，提示Ⅰ型脊灰病毒在這些密碼子的使用上偏好性較強(qiáng)；密碼子GCG、CGA、CGG、CGC、UCG和ACG的RSCU值均≤0.5，提示Ⅰ型脊灰病毒在這些密碼子的使用上偏好性較弱。

表2 40株Ⅰ型脊灰病毒毒株基因密碼子的RSCU值

2.2 Ⅰ型脊灰病毒ENc值 1～40號Ⅰ型脊灰病毒毒株的ENc值分別是53.710、53.741、53.749、53.137、53.082、52.924、53.370、54.230、53.291、53.506、53.204、53.356、53.705、53.194、53.914、53.276、53.435、54.508、54.038、54.059、54.554、53.338、53.396、53.450、53.401、53.491、53.301、53.810、54.640、53.856、54.414、53.231、53.351、54.090、54.126、54.386、53.404、53.066、53.236、53.345，平均值為53.633，說明Ⅰ型脊灰病毒在密碼子使用偏好性上處于較弱水平。

2.3 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見圖1。由圖1可知，40株Ⅰ型脊灰病毒毒株均位于(C+G)3%標(biāo)準(zhǔn)曲線以下，并聚集在一起，說明自然選擇在Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性上起主要作用。

圖1 Ⅰ型脊灰病毒ENc與(C+G)3%關(guān)聯(lián)性

2.4 不同時(shí)間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性分析結(jié)果 經(jīng)主成分分析獲得主因子1(Fac1)=19.802和主因子2(Fac2)=18.342，并以此為基礎(chǔ)繪制散點(diǎn)圖，見圖2。由圖2可知：①2009年之前分離出來的毒株均位于圖的下方，提示2009年之前分離出來的Ⅰ型脊灰病毒毒株基因密碼子使用模式基本相同；②2009年之后，分離于不同國家或地區(qū)的毒株分別聚集于圖的一處，說明其有明顯的地域性，如分離于中東地區(qū)(包括以色列和埃及)和1株巴基斯坦的毒株分布于圖表的右上角，且明顯區(qū)別于其他地區(qū)分離的毒株；分離于非洲地區(qū)(包括喀麥隆、赤道幾內(nèi)亞和乍得)的毒株分布于X軸的遠(yuǎn)端，且該區(qū)域僅有非洲分離毒株；分離于中亞地區(qū)(俄羅斯、哈薩克斯坦、塔吉克斯坦和土庫曼斯坦)的毒株加上3株巴基斯坦的分離毒株聚集于一處，提示2009年之后，不同地域分離出來的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用使用模式不同。

3 討論

雖然我國自1994年后就無脊灰野毒株病例的報(bào)道，但WHO至今仍將中國列為脊灰輸入高風(fēng)險(xiǎn)國家，主要原因?yàn)?017年全球未阻斷本土脊灰野病毒傳播的國家僅剩尼日利亞、阿富汗和巴基斯坦3個(gè)國家，而其中2個(gè)國家均與我國接壤。而且隨著海外勞務(wù)輸出和進(jìn)口貿(mào)易的規(guī)模逐年增大，導(dǎo)致脊灰病毒傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)居高不下，以致2011年我國新疆維吾爾族自治區(qū)發(fā)生了由巴基斯坦輸入的脊灰野病毒引起的疫情。與此同時(shí)，研究人員從急性弛緩性麻痹病例的糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了疫苗衍生脊灰病毒，說明對脊灰病毒的防范一刻都不能松懈[13,14]。

圖2 40株Ⅰ型脊灰病毒毒株的主成分分析圖

本研究對40株Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子RSCU值的分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型脊灰病毒在AGA、AGG、CCA、UCA、GUG等密碼子的使用上偏好性較強(qiáng)，在GCG、CGA、CGG、CGC、UCG、ACG等密碼子的使用上偏好性較弱。Ⅰ型脊灰病毒ENc值分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型脊灰病毒在密碼子使用偏好性上處于較弱水平。進(jìn)一步進(jìn)行的ENc與(C+G)3%的關(guān)聯(lián)分析，揭示了自然選擇在Ⅰ型脊灰病毒的進(jìn)化過程中擔(dān)當(dāng)了主要角色。之后的主成分分析結(jié)果顯示，自然選擇通過地理和時(shí)間因素影響了Ⅰ型脊灰病毒的進(jìn)化方向，尤其是地理因素將不同區(qū)域的毒株隔離開來，即同一區(qū)域分離的毒株在密碼子使用模式上具有較多的相似性，而不同區(qū)域則差異較大。

巴基斯坦作為緊鄰中亞的穆斯林國家，其獨(dú)特的地理和宗教因素導(dǎo)致其與中亞以及中東國家有較多經(jīng)濟(jì)和文化聯(lián)系[15～17]。2013年，在巴基斯坦同時(shí)分離出與中東地區(qū)和中亞地區(qū)相似密碼子使用模式的毒株，意味著Ⅰ型脊灰病毒在巴基斯坦流行毒株的遺傳多樣性[18,19]。近年來，隨著“一帶一路”的提出，中巴經(jīng)濟(jì)文化的往來頻繁，兩國關(guān)系不斷升溫，這也加大了我國對脊灰病毒防疫的任務(wù)。

綜上所述，Ⅰ型脊灰炎病毒密碼子使用偏好性較弱，自然選擇在Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用偏好性上起主要作用，不同時(shí)間和地域的Ⅰ型脊灰病毒基因密碼子使用模式差異較大。今后對Ⅰ型脊灰病毒乃至整個(gè)脊灰病毒的防疫工作依舊面臨諸多問題和挑戰(zhàn)，也需要科研人員的進(jìn)一步努力。