直腸癌組織中miR-144、ROCK-1 mRNA表達(dá)變化及其意義

宋志崗，劉帥，郭靜華，連彥軍，宋炳輝

(1 邢臺(tái)市第三醫(yī)院，河北邢臺(tái)054000；2 邢臺(tái)市第五醫(yī)院)

直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來(lái)隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)病率與死亡率有逐漸升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康[1]。手術(shù)治療、化療等是目前主要治療方案，但直腸癌晚期患者的惡性程度高，治療效果不理想，預(yù)后較差，因而，有必要深入研究其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制[2]。微小RNA(miRNA)是一類(lèi)小型內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度約18～25 bp，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞周期及凋亡調(diào)控，還可參與炎癥、免疫及腫瘤惡性進(jìn)展等過(guò)程[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織中存在多種miRNA的異常表達(dá)，其可通過(guò)結(jié)合下游靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)改變mRNA的穩(wěn)定性，影響靶基因的表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)過(guò)程。有研究[5]報(bào)道，檢測(cè)糞便中miR-144表達(dá)水平有助于早期診斷結(jié)直腸癌。研究[6]表明，miR-144是細(xì)胞分化、增殖、凋亡及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可在轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，而在高級(jí)別、進(jìn)展期惡性腫瘤中，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1作為一種內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA，可進(jìn)一步抑制miR-144的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，與患者不良預(yù)后密切有關(guān)。研究[7]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-144作為一種腫瘤抑制性miRNA，可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在小GTP酶RhoA的下游起作用。ROCK的不同亞型與多種細(xì)胞功能有關(guān)，包括平滑肌收縮、細(xì)胞分裂、細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)，其中ROCK-1是介導(dǎo)RhoA信號(hào)的關(guān)鍵介質(zhì)，參與細(xì)胞收縮、細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。有研究[8]表明，乳腺癌細(xì)胞中RhoA激活ROCK-1可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。因而，miR-144對(duì)直腸癌進(jìn)展的抑制作用可能與ROCK-1有關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)直腸癌組織中miR-144、ROCK-1 mRNA的表達(dá)情況，分析兩者間的相關(guān)性及與直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月～2018年10月在邢臺(tái)市第三醫(yī)院診治的直腸癌患者100例，其中男63例、女37例，年齡31～74歲，平均年齡(54.10±6.71)歲；伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者22例、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者78例，腫瘤直徑<5 cm者66例、≥5cm者34例，腫瘤分期Ⅰ期21例、Ⅱ期30例、Ⅲ期23例、Ⅳ期26例，病理分化為高分化者41例、中分化者32例、低分化者27例。所有患者均接受手術(shù)切除治療，術(shù)中留取癌組織及癌旁組織置于凍存管中，液氮速凍后，轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室置于-80 ℃冰箱保存。納入標(biāo)準(zhǔn)[9]：①經(jīng)腸鏡活檢和(或)術(shù)后病理檢查診斷為直腸腺癌。②所有患者均為首次診治，既往未接受過(guò)放化療及靶向藥物治療。③臨床病理資料完整，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者有炎性腸病、胰腺炎等消化系統(tǒng)疾病病史。②合并感染性疾病，如急性泌尿系感染、結(jié)核菌感染等。③合并其他器官惡性腫瘤。④病理學(xué)診斷不明確或臨床病理資料不完整。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 直腸癌組織及癌旁組織中miR-144、ROCK-1 mRNA檢測(cè)方法 采用qRT-PCR法。取20～30 mg的組織標(biāo)本，TRIzol法提取組織中總RNA。以總RNA為模板，用Taq Man反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR引物和探針均購(gòu)自ABI生物公司。引物序列如下：miR-144正向引物為5′-GCTGGGATATCATCATATACTG-3′，反向引物為5′-CGGACTAGTACATCATCTATACTG-3′；ROCK-1正向引物為5′-AAG AGAGTGATATTGAGCAGTTGCG-3′，反向引物為5′-TTCCTCTATTTGGTACAGAAAGCCA-3′；內(nèi)參基因β-actin正向引物為5′-GGTGATCCACATCTGCTGGAA-3′，反向引物為5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGGG-3′。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 20 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)均在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌組織與癌旁組織中miR-144、ROCK1 mRNA表達(dá)比較 直腸癌組織中miR-144、ROCK-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.48±0.06、0.96±0.20，癌旁組織中miR-144、ROCK-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.98±0.07、0.24±0.12，兩者相比，P均<0.05。

2.2 直腸癌組織中miR-144、ROCK-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 直腸癌癌組織中miR-144、ROCK-1 mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.683，P=0.002)。

2.3 miR-144、ROCK-1 mRNA表達(dá)與直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果見(jiàn)表1。miR-144、ROCK-1 mRNA表達(dá)與直腸癌患者腫瘤分化和腫瘤分期有關(guān)(P均<0.05)。

表1 miR-144、ROCK-1 mRNA表達(dá)與直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2012年我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病人數(shù)達(dá)到25.3萬(wàn)例。直腸癌晚期患者或直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的患者腫瘤特異性死亡率較高，預(yù)后較差[10]。因此有必要對(duì)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制進(jìn)行深入探討。近年來(lái)研究[11]表明，直腸癌中存在多種miRNA的表達(dá)異常改變，但它們?cè)谥蹦c癌發(fā)展和進(jìn)展中的潛在分子機(jī)制仍未完全闡明。因此，有必要研究參與直腸癌進(jìn)展的miRNA的功能，尋找潛在的靶基因，以尋找調(diào)控腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為直腸癌診斷和治療提供新的研究思路。

miR-144位于人類(lèi)染色體17q11.2，其基因包含一個(gè)外顯子，最早在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其參與紅細(xì)胞譜系成熟的調(diào)節(jié)。此外，在胰腺癌[12]、胃癌[13]和甲狀腺癌[14]等多種腫瘤中也存在miR-144表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，其可通過(guò)結(jié)合富含脯氨酸的蛋白11(PRR11)3′端非編碼區(qū)，抑制PRR11的表達(dá)。此外，miR-144還可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶途徑，促進(jìn)Jun氨基末端激酶和p38的磷酸化，下調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的表達(dá)，最終抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖。在本研究中，直腸癌組織中miR-144的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，與以往報(bào)道[15]一致。目前其具體機(jī)制尚不清楚，可能與miR-144基因位點(diǎn)雜合性缺失有關(guān)，也可能與miR-144基因表觀遺傳學(xué)修飾后功能失活有關(guān)。此外，本研究中miR-144的表達(dá)與直腸癌患者的腫瘤分化、腫瘤分期有關(guān)，提示miR-144表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力是癌癥的重要標(biāo)志，這個(gè)過(guò)程需要通過(guò)細(xì)胞骨架系統(tǒng)的重塑和細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的接觸來(lái)促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。Rho家族的小GTP酶在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織和運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要作用[16]。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，其通過(guò)與Rho GTP酶的相互作用調(diào)節(jié)，通過(guò)磷酸化多種下游靶蛋白來(lái)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白引起的收縮，進(jìn)而控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移。ROCK信號(hào)在腫瘤、糖尿病腎病等疾病中發(fā)揮重要的作用，其中ROCK-1是介導(dǎo)RhoA信號(hào)的關(guān)鍵介質(zhì)，參與細(xì)胞收縮、細(xì)胞凋亡、遷移和侵襲的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。本研究中，直腸癌組織中ROCK1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織，表明直腸癌發(fā)生時(shí)ROCK-1表達(dá)增加。我們認(rèn)為，ROCK1 mRNA的表達(dá)升高可能與抑制其表達(dá)的miRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)，使ROCK-1 mRNA穩(wěn)定性增加[17]。此外，本研究中直腸癌組織中ROCK-1 mRNA的表達(dá)與腫瘤分化和腫瘤分期有關(guān)，提示直腸癌組織中ROCK-1的表達(dá)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究[18]表明，P53基因作為一種抑癌基因，其突變或缺失多發(fā)生于高級(jí)別、進(jìn)展期惡性腫瘤中，ROCK-1可作為p53的生理調(diào)節(jié)因子，與p53結(jié)合并調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性及表達(dá)，p53基因突變后失去與ROCK-1結(jié)合的能力，導(dǎo)致ROCK-1水平升高。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[19，20]中，通過(guò)在直腸癌細(xì)胞系SW837、SW1463細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ROCK-1后，miR-144對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖的抑制作用得到逆轉(zhuǎn)。本研究進(jìn)一步研究直腸癌癌組織中miR-144與ROCK-1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果表明兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其可能的機(jī)制是，miR-144通過(guò)下調(diào)ROCK-1的表達(dá)抑制直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，直腸癌組織中miR-144表達(dá)降低，而ROCK-1 mRNA表達(dá)升高，兩者共同參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為直腸癌診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的新腫瘤標(biāo)志物，但對(duì)于兩者之間具體作用途徑有待進(jìn)一步研究。