小鼠不同生長階段骨骼肌組織中Myf5 的表達(dá)

冀云燕，薛霖莉，2，曹 靖，李藝?yán)祝稳A偉，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，耿建軍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京102442）

肌源性因子5（Myogenic factor 5，Myf5）是肌源性調(diào)節(jié)因子家族成員，是骨骼肌調(diào)節(jié)基因[1]，負(fù)責(zé)脊椎動物胚胎的骨骼肌生成[2]，在骨骼肌形成初期對肌原細(xì)胞增殖分化起主要作用[3]，與肌原性分化密切相關(guān)[4]。

DUPREZ 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 可以在體外迫使非肌肉細(xì)胞中的肌原性轉(zhuǎn)化，Myf5 表達(dá)與成肌細(xì)胞增殖相關(guān)。KURYL 等[6]研究認(rèn)為，Myf5 基因?qū)τ谪i屠體瘦肉的含量和眼肌肉的面積都具有非常重要的影響。LIU 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在大白豬×梅山豬的F2群體之中，Myf5 基因的Hsp9211 位點(diǎn)對豬背最長肌的肌間脂肪（P＝0.04）和吸水力都有非常明顯的影響（P＝0.000 1）。孫文浩[8]對雞的研究表明，Myf5基因的單倍型組合對于雞的胸肌質(zhì)量、腿肌質(zhì)量、活體質(zhì)量、屠體質(zhì)量具有非常明顯的影響（P＜0.05），而且Myf5 基因單倍型組合也對肌纖維的密度以及肌纖維的直徑都有顯著影響（P＜0.05）。BEAUCHAMP[9]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 的表達(dá)與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞密切相關(guān)，Myf5 缺失小鼠表現(xiàn)出在凍傷后肌纖維肥大，延遲分化，脂肪細(xì)胞積聚和纖維化顯著增加[10]，缺乏Myf5 小鼠不能形成成肌細(xì)胞[11]。FRIDAY 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 在骨骼肌的測定、發(fā)育和分化中起重要作用，在衛(wèi)星細(xì)胞被激活時(shí)最先表達(dá)Myf5[13]，Myf5 能夠?qū)⒃S多非肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌肉[14]。

本試驗(yàn)通過研究Myf5 基因在小鼠不同發(fā)育階段骨骼肌組織中的表達(dá)情況，探索其在小鼠骨骼肌組織表達(dá)的規(guī)律，旨在揭示骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)Myf5 基因的功能研究以及肌肉疾病的預(yù)防、治療提供相關(guān)理論依據(jù)

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 共選取16 只健康小鼠，即幼齡小鼠（7 日齡）、性成熟小鼠（21～28 日齡）、體成熟小鼠（42～56 日齡）和老齡小鼠（84 日齡以上）各4 只，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 氯仿、異丙醇、無水乙醇（天津天大化工）、RNAisoPlus、PrimeScriptTMRTreagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR PremixExTap（Takara）、Myf5 抗體（三鷹）、β-actin（三鷹）等；高壓蒸汽滅菌器（Sabyo 公司）；光學(xué)顯微鏡（Leica 公司）、普通MYF5 儀（Bio-Rad 公司）、Mx3000P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀及相應(yīng)的檢測軟件（Agilent）、高速冷凍離心機(jī)（Sigma 公司）、凝膠成像儀（Panasonic 公司）、超凈工作臺（SW-CJ-CO 型，蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 取材 通過斷頸使小鼠安樂死，將小鼠用70%酒精徹底噴灑（以防止小鼠皮毛污染），用鑷子拾起腹部皮膚，然后用鋒利的剪刀做一個(gè)縱向切口，沿相反方向剝?nèi)テつw，沿脛骨兩側(cè)插入和延伸剪刀，切除腓腸肌，分為2 份，一份快速放入液氮速凍，一份放入固定液固定。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 試驗(yàn)所用引物均根據(jù)GenBank Myf5 基因?qū)?yīng)（登錄號：17877）的小鼠序列，采用Premier 5.0 軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 引物設(shè)計(jì)，由北京華大公司合成（表1）。

表1 引物序列信息

1.2.3 普通PCR 擴(kuò)增 以小鼠骨骼肌cDNA（100 ng/μL）為模板，10 μL 體系進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增：2×Taq Master Mix 5 μL，待測上游引物0.4 μL，待測下游引物0.4 μL，cDNA 100 ng，ddH2O 補(bǔ)足10 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，梯度退火溫度30 s，72 ℃延伸20 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終止延伸5 min。產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂凝膠電泳。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以小鼠骨骼肌cDNA（100 ng/μL）為模板，10 μL 體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，待測基因上游引物0.4 μL，待測基因下游引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ0.2 μL，CDNA 100 ng，ddH2O 補(bǔ)足10 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 組織包埋、石蠟切片制作及HE 染色Bouins 固定脫蠟，梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、包埋，凝固后4 ℃長期保存。石蠟切片去5 μm厚，常規(guī)HE 染色后使用中性樹脂封片。用顯微鏡觀察組織不同發(fā)育階段形態(tài)學(xué)差異。

1.2.6 免疫組織化學(xué)分析 脫蠟、封閉內(nèi)源性過氧化物酶與阻斷異性抗原、滴加已稀釋一抗（4 ℃過夜），滴加二抗（37 ℃30 min），顯色、復(fù)染、脫水與封片、鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠不同生長時(shí)期骨骼肌的組織形態(tài)學(xué)變化

從圖1 可以看出，幼齡小鼠的細(xì)胞核多位于細(xì)胞邊緣，肌纖維的橫切面近似圓形；性成熟、體成熟小鼠的肌纖維多排列致密，呈簇排列，胞核多位于周邊，肌纖維的橫切面近似多邊形；老齡小鼠肌纖維排列松散，肌束間間隙增大。表明從幼齡到體成熟階段，隨著年齡的不斷增加，肌纖維在不斷生長，肌纖維的直徑不斷增加，肌纖維的橫切面由近似圓形逐漸變?yōu)槎噙呅危∈帕懈泳o密；而在老齡階段，肌束間的間隙逐漸增大。

2.2 小鼠不同生長時(shí)期骨骼肌中Myf5 的表達(dá)

由圖2 可知，陽性組和陰性組明顯不同，陰性組細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，胞質(zhì)為淡粉色。表明Myf5 的表達(dá)定位于細(xì)胞核中，Myf5 在幼年、體成熟、性成熟、老年小鼠的4 個(gè)不同發(fā)育階段的骨骼肌中均有表達(dá)，且免疫組織化學(xué)結(jié)構(gòu)染色深淺不一，陽性組幼齡階段著色較深。表明Myf5 在幼年階段的表達(dá)量較多，而在性成熟、體成熟、老年階段的表達(dá)量相對較少。

2.3 Myf5 基因在小鼠不同生長時(shí)期骨骼肌中的表達(dá)

為了選出Myf5 基因的最佳退火溫度，在PCR 擴(kuò)增過程中設(shè)置溫度梯度54.0～61.0 ℃，中央57.5 ℃，跨度7.0 ℃，根據(jù)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳。由圖3 可知，產(chǎn)物片段為172 bp，第3 泳道無雜帶，而且清晰明亮，沒有拖尾現(xiàn)象。因此，最適的退火溫度為57.5 ℃。

2.4 Myf5 mRNA 在小鼠不同生長時(shí)期骨骼肌中的表達(dá)變化

由圖4，5 可知，擴(kuò)增溶解曲線基線單一，基本平直，無明顯的上揚(yáng)趨勢，說明定量的曲線符合預(yù)期，可以用于試驗(yàn)。按照試驗(yàn)過程中的定量結(jié)果，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并繪制圖6，結(jié)果顯示，Myf5 mRNA 在小鼠4 個(gè)不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但表達(dá)存在差異性。幼年小鼠、性成熟小鼠、體成熟小鼠的Myf5 mRNA 表達(dá)極顯著低于老年小鼠（P＜0.001），Myf5 mRNA 的表達(dá)量與小鼠的生長發(fā)育階段有一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

肌源性因子5 是一種人體內(nèi)由Myf5 基因編碼的蛋白質(zhì)[15]，在調(diào)節(jié)肌肉分化或肌生成，特別是骨骼肌的發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16-17]。Myf5 在肌源性分化中起著重要作用[18]。此外，Myf5 是肌肉發(fā)育的主要調(diào)控因子，在成纖維細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，具有誘導(dǎo)肌肉表型的能力[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 在早期體細(xì)胞的皮肌組中表達(dá)，能促使肌源性前體分化為成肌細(xì)胞[20]，肌生成方面發(fā)揮作用的同時(shí)，也間接控制了近端肋骨的發(fā)育與骨骼肌再生[21-23]。Myf5 是衛(wèi)星細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞標(biāo)志物之一，在肌肉損傷再生中起著重要作用[24]，當(dāng)肌肉發(fā)生損傷時(shí)，處于靜止?fàn)顟B(tài)的衛(wèi)星細(xì)胞被激活，通過增殖、分化后重新形成新的骨骼肌細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)骨骼肌損傷修復(fù)[25]。

SMITH 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 在不同階段均有表達(dá)。BRAUN 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 是成肌特化的主要調(diào)節(jié)因子，其不僅決定了成肌細(xì)胞的早期命運(yùn)，而且也在成肌細(xì)胞的早期分化中起著重要的作用，Myf5 與失神經(jīng)骨骼肌萎縮的發(fā)生有關(guān)。本試驗(yàn)探究Myf5 在不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌的表達(dá)定位，結(jié)果顯示，Myf5 在小鼠的不同發(fā)育階段骨骼肌上均有表達(dá)，但表達(dá)量各有不同，其中，幼年、性成熟、體成熟小鼠中Myf5 表達(dá)量顯著低于老年小鼠。表達(dá)量與小鼠心肌細(xì)胞的發(fā)育具有相關(guān)性。曹婷等[28]對五指山豬的研究表明，在出生后的五指山豬的背部肌肉組織中的表達(dá)水平與其生長的年齡成正比（P＜0.05）。魏園丁等[29]對鴨胸肌的研究顯示，胸肌和腿肌中Myf5 的表達(dá)量分別在27，14 胚齡達(dá)到高峰隨后緩慢降低。張濤等[30]對京海黃雞的研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 基因在幼齡時(shí)期表達(dá)量最高，隨著年齡增長呈下降趨勢。在損傷的情況下細(xì)胞周期激活，這可能是因?yàn)镸yf5 基因突變型導(dǎo)致數(shù)量增加的原因，且不能排除Myf5 基因的積累，是造成小鼠骨骼肌Myf5 表達(dá)在老年期高的原因。