卡托普利通過抑制氧化應(yīng)激損傷和減輕炎癥反應(yīng)對(duì)冠脈微栓塞大鼠發(fā)揮心肌保護(hù)作用*

霍艷萍, 焦安德, 劉玉梅, 張孝麗

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科， 黑龍江 齊齊哈爾 161000； 2齊齊哈爾市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161000； 3齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌三科， 黑龍江 齊齊哈爾 161000)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病是由于冠脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變導(dǎo)致血管的狹窄或阻塞，造成心肌細(xì)胞的缺血缺氧，甚至引起心肌細(xì)胞的壞死而導(dǎo)致的心臟病[1]。雖然近來對(duì)冠心病的診治手段不斷得到提高，但由于居民不良生活習(xí)慣和人口老年化，冠心病的患病率和致死率仍居高不下，因此該疾病備受關(guān)注[2-3]。雖然冠心病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但很多研究結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)[4]、氧化應(yīng)激[5]和鈣超載[6]參與了該機(jī)制，并協(xié)同作用造成心肌細(xì)胞功能紊亂和凋亡的發(fā)生，從而導(dǎo)致心臟功能的損傷。因此需要進(jìn)一步的研究來充分認(rèn)識(shí)上述病理因素對(duì)心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制，有助于尋找新的治療策略。

細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化損傷在冠脈栓塞損傷中起著重要作用。心肌細(xì)胞缺血后，單核細(xì)胞、白細(xì)胞以及其它炎癥細(xì)胞開始滲透到心肌組織損傷區(qū)域。然后活化后的巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能募集更多的中性粒細(xì)胞到心肌損傷區(qū)域，進(jìn)一步加重心肌損傷[7]。結(jié)果表明，冠脈栓塞后的炎癥反應(yīng)促進(jìn)心肌損傷[8]。此外，心肌細(xì)胞缺血缺氧后誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。因此，抑制心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少氧化損傷，可有效減輕冠脈栓塞引起的心臟損傷。

卡托普利(captopril，CAP)作為第1代的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，被應(yīng)用在治療高血壓和某些類型的心力衰竭的治療[10]。CAP通過改善心肌重構(gòu)和降低炎癥因子釋放提高心肌梗死的療效和改善患者心功能[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，CAP可通過增強(qiáng)抗氧化標(biāo)志物的活性發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用[12]。然而，CAP治療冠脈栓塞的潛在機(jī)制仍不清楚。因此，本項(xiàng)工作利用冠脈微栓塞(coronary microembolization，CME)大鼠模型，探討CAP對(duì)CME后損傷的心肌是否具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步對(duì)CAP介導(dǎo)的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠(SPF級(jí)，雄性，220～250 g，6周齡，共18只)購自于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(黑)2016-001，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠在室溫(23±2)℃、濕度(55±5)%的環(huán)境飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)所有過程均得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染料、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒和過氧化氫酶試劑盒購自中國酶聯(lián)科研公司；卡托普利原料藥由東北制藥公司饋贈(zèng)；磷酸鹽緩沖液(phosphate -buffered saline，PBS)、同型IgG、RIPA裂解液、BCA試劑盒和Triton X-100均購自Invitrogen；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和5%牛血清白蛋白購自Roche；抗cleaved caspase-3和Bax抗體及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗購自Cell Signaling Technology；二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)染料購自Sigma。

3 方法

3.1動(dòng)物模型的建立 6周齡SD大鼠進(jìn)行適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行CME造模。用鹽酸戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后行氣管插管，接呼吸機(jī)輔助呼吸。沿大鼠胸骨左緣第3和4肋間隙打開胸腔，分離升主動(dòng)脈，用血管夾夾閉升主動(dòng)脈20 s，用注射器從大鼠左心室心尖部向左心室注入0.2 mL的自身血栓微粒(粒徑40 μm)，觀察大鼠心跳呼吸，待心跳呼吸平穩(wěn)后關(guān)閉胸腔和拔除氣管插管。術(shù)后予以160萬單位的青霉素腹腔注射預(yù)防感染。對(duì)照組予以注射同量的生理鹽水。

3.2實(shí)驗(yàn)分組 SD大鼠被隨機(jī)分配到3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組有6只大鼠，分別是：(1)假手術(shù)對(duì)照(sham)組；(2)CME組；(3)CME+CAP(40 mg/kg)組：大鼠在術(shù)前7 d，每天口服喂養(yǎng)含有卡托普利的生理鹽水(每日1次)。對(duì)照組和CME組同時(shí)給予等量的生理鹽水。

3.3心肌組織病理分析 處死各實(shí)驗(yàn)組的大鼠并取出心臟，把心肌組織固定在10%福爾馬林溶液。心肌組織經(jīng)過石蠟包埋后制成厚度約為4 μm的切片。選取梗死區(qū)心肌切片并進(jìn)行HE染色。每張HE染色切片在BX51型倒置顯微鏡(Olympus)下觀察，并隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行拍照。利用ImageJ軟件分析心肌細(xì)胞直徑和炎癥細(xì)胞侵潤。

3.4免疫組化 按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書步驟對(duì)心肌組織切片行染色處理：心肌組織依次置于二甲苯中脫蠟和梯度乙醇水化；用蛋白酶K工作液在室溫下處理切片15 min，用PBS洗滌3次；加入配好的TUNEL反應(yīng)工作液室溫孵育1 h；甲醇溶液室溫處理10 min，PBS洗滌3次；過氧化物酶溶液37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次;加入二氨基聯(lián)苯胺顯色，PBS洗滌3次，用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，再次脫水；封片并在BX51型倒置顯微鏡(Olympus)下觀察并拍照。選取梗死區(qū)域進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比計(jì)數(shù)。

3.5免疫熒光 各組大鼠梗死區(qū)的心肌組織用丙酮固定并制成厚度約10 μm的冰凍切片。切片用0.3%的Triton X-100在PBS中浸泡，然后再室溫下用5%牛血清白蛋白封閉30 min。利用cleaved caspase-3抗體與樣品進(jìn)行4℃過夜孵育。孵育后用PBS反復(fù)清洗3次。用同型IgG再次孵育樣品1 h。DAPI用于細(xì)胞核染色。最后在FV3000型熒光共聚焦顯微鏡(Olympus)下對(duì)樣品進(jìn)行觀察，并用ImageJ軟件分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。

3.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 把各組梗死區(qū)的的心肌組織利用組織RIPA裂解液萃取蛋白。采用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取20 μg樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V，時(shí)間為2 h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并分別以1 ∶1 000的稀釋比例孵育Ⅰ抗(cleaved caspase-3和Bax抗體)， 4 ℃過夜。次日，以TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的Ⅱ抗1 h，最后以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。以β-actin為內(nèi)參照，利用ImageJ軟件分析目的蛋白相對(duì)灰度值。

經(jīng)過 NSGA-II算法迭代50次后，由于備選設(shè)備庫容量相對(duì)較小，出現(xiàn)部分解的重疊現(xiàn)象，最終得到27個(gè)Pareto最優(yōu)解，如圖4所示。以設(shè)備的總價(jià)格最低為標(biāo)準(zhǔn)，選型最優(yōu)的4個(gè)點(diǎn)在圖中用箭頭標(biāo)出。4個(gè)Pareto的最優(yōu)解見表7。

3.7SOD和過氧化氫酶檢測(cè) 利用SOD檢測(cè)試劑盒和過氧化氫酶試劑盒按照實(shí)驗(yàn)說明書步驟通過酶標(biāo)法對(duì)源自各組梗死區(qū)的心肌組織進(jìn)行檢測(cè)。采用ELx800型酶標(biāo)儀(BioTek)檢測(cè)450 nm波長處A值。樣品的SOD和過氧化氫酶濃度分別按照預(yù)制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

3.8活性氧(reactive oxygen species，ROS)濃度檢測(cè) 利用DHE染料對(duì)各組的大鼠梗死區(qū)心肌組織進(jìn)行染色標(biāo)記20 min，用PBS洗滌3次。在FV3000型熒光共聚焦顯微鏡(Olympus)下觀察，并用ImageJ軟件分析相對(duì)熒光強(qiáng)度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究利用GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于多組定量資料的兩兩比較，數(shù)據(jù)在滿足正態(tài)分布和方差齊的條件下，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，利用單因素方差分析后續(xù)檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CAP減少冠脈栓塞導(dǎo)致的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和炎癥細(xì)胞浸潤

通過HE染色評(píng)估CAP處理前后CME模型的心肌組織形態(tài)結(jié)果的變化。與對(duì)照組相比，CME組顯示出心肌層結(jié)構(gòu)紊亂，且少部分心肌細(xì)胞發(fā)生變性壞死(箭頭處)和炎癥細(xì)胞浸潤(P<0.01)；與CME組相比，用CAP預(yù)處理組炎癥細(xì)胞浸潤(P<0.01)和心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)(P<0.05)改變減少，見圖1。

Figure 1.CAP protected against the structural changes of the myocardium induced by CME. A: representative images of HE staining. B: quantification of inflammatory cell infiltration in each group; C: quantification of cross-sectional diameter of the cardiomyocytes in each group. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsCME group.

圖1 CAP減輕CME誘導(dǎo)的心肌結(jié)構(gòu)改變

2 CAP減少CME心肌細(xì)胞的凋亡

利用TUNEL法檢測(cè)CAP對(duì)CME后心肌細(xì)胞凋亡的影響。TUNEL染色后，凋亡細(xì)胞呈棕色。與對(duì)照組相比，CME組的凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；然而CAP處理后CME導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.01),見圖2。

Figure 2.CAP reduced the cardiomyocyte apoptosis induced by CME. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCME group.

圖2 CAP減少CME誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

3 CAP抑制心肌cleaved caspase-3和Bax表達(dá)

通過熒光共聚焦顯微鏡和Western blot分析評(píng)估了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。CME后cleaved caspase-3熒光強(qiáng)度較對(duì)照組升高,心肌的cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01),而CAP處理后cleaved caspase-3熒光強(qiáng)度降低，心肌組織中cleaved caspase-3和Bax蛋白水平下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

4 CAP對(duì)抗氧化標(biāo)志物的作用

5 CAP對(duì)ROS的影響

經(jīng)CME造模鼠模型中提取的心肌內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度較對(duì)照組細(xì)胞顯著增加(P<0.01)；而予以CAP處理后CME的促ROS作用得到顯著抑制(P<0.01)，見圖5。

討 論

冠心病是世界上許多國家最嚴(yán)重危害人類身體健康的疾病之一，也是最常見的死亡原因。盡管已經(jīng)開展了眾多對(duì)于冠心病的研究并取得了一定的成果，但有效的治療冠心病策略減輕和延緩心肌損傷藥物還待進(jìn)一步探索。已有研究報(bào)道CAP具有抗氧化、抑炎和改善心功能的作用[11-12]。然而，CAP治療冠脈栓塞的潛在機(jī)制仍不清楚?？紤]到不同影響因素造成冠心病的機(jī)制差異，因此，我們開展了CAP對(duì)CME后心肌細(xì)胞功能的有關(guān)病理機(jī)制的研究。

細(xì)胞凋亡是決定冠脈栓塞心肌損傷程度的特征性變化之一[13]。此外，心肌細(xì)胞凋亡程度嚴(yán)重影響冠心病治療的有效性和患者的預(yù)后[14]。心肌細(xì)胞凋亡的減少已被研究證明能改善冠脈栓塞后的心肌功能，延緩心肌重塑過程[13]。據(jù)研究表明CAP可有效減少急性心肌梗死[11]、肝毒性[15]和腎功能不全[16]等疾病中的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果也表明，CAP可顯著抑制CME后心肌細(xì)胞凋亡，提示CAP對(duì)心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

既往研究表明，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)后可產(chǎn)生大量的ROS，過量ROS發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死和炎癥反應(yīng)[17]。消除ROS的抗氧化物有SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等。增強(qiáng)抗氧化活性，消除過量ROS水平可在一定程度上減少細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAP可以抑制CME誘導(dǎo)的ROS生成水平，促進(jìn)SOD和過氧化氫酶的活性。這一結(jié)果提示，CAP可能通過抗過氧化應(yīng)激來抑制心肌細(xì)胞凋亡和心肌炎癥反應(yīng)。但對(duì)于CAP如何降低ROS的相關(guān)機(jī)制需要我們將來深一步研究。另外，CME后ROS通過何種途徑誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心肌炎癥反應(yīng)；CAP是否可以通過參與這些途徑發(fā)揮其抵抗CME誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和心肌炎癥反應(yīng)也值得進(jìn)一步探討。

綜上所述，卡托普利在CME大鼠上具有抗氧化應(yīng)激損傷和減輕炎癥反應(yīng)的作用，對(duì)CME后心肌起到保護(hù)作用。該研究結(jié)果為未來卡托普利治療冠脈栓塞相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用提供了參考資料。

Figure 3.CAP inhibited the expression of cleaved caspase-3 and Bax induced by CME in myocardial tissue. A： representative immunofluorescence images and quantification of fluorescence intensity of cleaved caspase-3 in cardiomyocytes (scale bar=50 μm); B： representative Western blot images and quantification of protein levels of cleaved caspase-3 and Bax in different groups. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCME group.

圖3 CAP抑制CME誘導(dǎo)的心肌cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)

Figure 4.Effects of CAP on SOD and catalase activity in myocardial tissues under CME condition. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCME group.

圖4 CAP對(duì)冠脈微栓塞后心肌SOD和過氧化氫酶活性的影響

Figure 5.CAP inhibited the levels of ROS induced by CME in myocardial tissues. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=6.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCME group.

圖5 CAP抑制CME誘導(dǎo)的心肌ROS水平