浙江金線蓮組織培養(yǎng)體系的建立

陳常理，駱霞虹，唐楠楠，余楊，安霞，李文略，朱關(guān)林，李珊，程舟，金關(guān)榮*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蕭山棉麻研究所，浙江 杭州 311202；2.同濟(jì)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092；3.浙江省麗水市科技局生產(chǎn)力促進(jìn)中心，浙江 麗水 323000)

浙江金線蓮(Anoectochiluszhejiangensis)為蘭科開唇蘭屬多年生珍稀草本植物，主要分布在浙江、福建等地，作為一種珍貴中草藥，具有廣闊的開發(fā)利用前景[1]。浙江金線蓮的生物學(xué)特性和藥理活性與同屬基原植物金線蓮相近，對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較嚴(yán)格，自然萌發(fā)率不到千分之一，自然繁殖時(shí)間長(zhǎng)且繁殖率不高，再加上近年來人為大量采挖，導(dǎo)致浙江金線蓮野生資源日趨枯竭，因此，保護(hù)野生浙江金線蓮已經(jīng)到了刻不容緩的地步[2]。

植物組織培養(yǎng)是保護(hù)瀕危植物的有效技術(shù)手段，可在短時(shí)間內(nèi)繁殖出大量新生植株。在組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的篩選將直接影響到組織培養(yǎng)的成功與否，植物激素的濃度配比將直接影響到植株快繁的效率。迄今為止，有關(guān)金線蓮基原植物，如臺(tái)灣金線蓮、金線蓮、福建金線蓮等快速繁殖體系的研究已有較多報(bào)道[3-4]，并發(fā)現(xiàn)不同基原植物間的快速繁殖體系相差較大，不同階段最適的激素配比也會(huì)有所差異[5]。但是關(guān)于浙江金線蓮組織培養(yǎng)方面的研究相對(duì)有限。為解決資源稀缺問題，有必要建立其快速繁殖的最優(yōu)體系。因此，本研究在本課題組前期已建立的金線蓮、臺(tái)灣金線蓮快速繁殖體系基礎(chǔ)上，以浙江金線蓮為材料，探討不同植物激素配比對(duì)類原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化和生根的影響，建立植株快速繁殖的最優(yōu)體系，為浙江金線蓮的擴(kuò)大培養(yǎng)打下基礎(chǔ)，也為今后對(duì)浙江金線蓮成分等方面的研究和開發(fā)利用提供有力的支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江金線蓮(ZJJ)組培苗由同濟(jì)大學(xué)麗水中藥研究院資源植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

類原球莖的誘導(dǎo)、增殖與分化以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，pH值5.8。液體培養(yǎng)基蔗糖濃度為5.0%，固體培養(yǎng)基蔗糖濃度為3.0%，類原球莖分化培養(yǎng)基中附加10%香蕉泥。所有培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻備用。

1.2.2 類原球莖的誘導(dǎo)

液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖。以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.2、0.4、0.6 mg·L-1TDZ和0.2、0.4、0.6 mg·L-1NAA[6]。取生長(zhǎng)健康的無菌苗，在超凈工作臺(tái)上將其葉片從柄部切除，氣生根從基部切除，將莖切成帶2～4個(gè)節(jié)的莖段，隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組4瓶，每瓶接種10個(gè)。第1次接種3 d后即更換培養(yǎng)基，以后每7 d更換1次培養(yǎng)基，接種31 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，取平均值計(jì)算其誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出類原球莖莖段數(shù)/接種莖段數(shù))×100%。

固體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖。以MS為基本培養(yǎng)基，選取0.2、0.3、0.4、0.6 mg·L-1TDZ，0.2、0.4 mg·L-1NAA和2.0 mg·L-16-BA配比組合進(jìn)行試驗(yàn)[6]。莖段處理與液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖的處理相同，隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶7～8個(gè)莖段，每7 d更換1次培養(yǎng)基，接種30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，取平均值計(jì)算其誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)效率。誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出類原球莖莖段數(shù)/接種莖段數(shù))×100%，誘導(dǎo)效率=(誘導(dǎo)出的類原球莖個(gè)數(shù)/接種莖段數(shù))×100%。

1.2.3 類原球莖的增殖

以MS為基本培養(yǎng)基，采用L9(34)正交試驗(yàn)研究稀效唑、6-BA和NAA對(duì)類原球莖增殖的影響。稀效唑的1、2、3水平分別為0.5、1.0、1.5 mg·L-1，6-BA的1、2、3水平分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA的1、2、3水平分別為0.2、0.4、0.6 mg·L-1。將誘導(dǎo)出的帶類原球莖的莖段隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組5瓶，每瓶接種10～15個(gè)，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，取平均值計(jì)算增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=(增殖出的類原球莖個(gè)數(shù)/總接種莖段數(shù))×100%。

1.2.4 類原球莖的分化

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、2.0 mg·L-16-BA和0.1、0.2、0.3 mg·L-1NAA進(jìn)行試驗(yàn)。將增殖培養(yǎng)后的類原球莖切割成團(tuán)，隨機(jī)接種到各組培養(yǎng)基中，每組5瓶，每瓶接種5個(gè)類原球莖團(tuán)，培養(yǎng)60 d統(tǒng)計(jì)分化情況，取平均值計(jì)算分化率。分化率=(分化的類原球莖數(shù)/接種類原球莖數(shù))×100%。

1.2.5 生根培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、1.5 mg·L-1IBA和0.5、1.0、1.5 mg·L-1NAA。將分化培養(yǎng)得到的幼嫩小苗(約2.0 cm)隨機(jī)接入生根培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶接種7～8個(gè)幼嫩小苗，培養(yǎng)60 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況，計(jì)算生根率。生根率=(生根幼嫩小苗數(shù)/總接種幼嫩小苗數(shù))×100%。

1.2.6 培養(yǎng)條件

類原球莖液體誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件為：90 r·min-1振蕩培養(yǎng)，光照時(shí)間12 h/12 h(L/D)。類原球莖固體誘導(dǎo)、增殖、分化和生根的培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，溫度為25 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 類原球莖的誘導(dǎo)

2.1.1 液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖

莖段經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，節(jié)間部位形成2～6個(gè)乳白色類原球莖(圖1)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)。結(jié)果(表1)表明：TDZ和NAA配合使用能誘導(dǎo)浙江金線蓮莖段長(zhǎng)出類原球莖，但不同激素對(duì)類原球莖的誘導(dǎo)效果影響不同。當(dāng)TDZ濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加類原球莖的誘導(dǎo)率沒有明顯變化，TDZ濃度為0.2 mg·L-1，NAA濃度分別為0.2、0.4、0.6 mg·L-1時(shí)，類原球莖的誘導(dǎo)率依次為10.8%、12.5%、9.2%。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著TDZ濃度的增加，類原球莖的誘導(dǎo)率有較為顯著的提高，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1，TDZ濃度分別為0.2、0.4、0.6 mg·L-1時(shí)，類原球莖的誘導(dǎo)率依次為10.8%、29.2%、50.0%?？梢姡琓DZ對(duì)類原球莖誘導(dǎo)效果的影響大于NAA，最佳的誘導(dǎo)條件為TDZ 0.6 mg·L-1、NAA 0.4 mg·L-1。

圖1 浙江金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)

表1 液體培養(yǎng)不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮類原球莖誘導(dǎo)的影響

2.1.2 固體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖

與液體培養(yǎng)誘導(dǎo)類原球莖類似，固體誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d左右，在莖段節(jié)間部位開始出現(xiàn)乳白色類原球莖。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出類原球莖的莖段數(shù)，結(jié)果如表2所示。TDZ、NAA和6-BA按不同的配比使用均能誘導(dǎo)浙江金線蓮莖段長(zhǎng)出類原球莖，但不同激素配比對(duì)金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)效果不同，從誘導(dǎo)率來看，3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)能力均較好，類原球莖誘導(dǎo)率無明顯差異。從誘導(dǎo)效率來看，5號(hào)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率最高，為144.6%，顯著高于其他4組。綜合誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)效率，固體培養(yǎng)基中類原球莖誘導(dǎo)最佳條件為TDZ 0.6 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1。

表2 固體培養(yǎng)不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮類原球莖誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示在0.05水平上存在顯著差異。表6～8同。

2.2 類原球莖的增殖

將誘導(dǎo)出類原球莖的莖段轉(zhuǎn)移至固體增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)60 d后觀察到新增殖的類原球莖數(shù)量眾多、生長(zhǎng)旺盛(圖2)。統(tǒng)計(jì)類原球莖個(gè)數(shù)，計(jì)算增殖系數(shù)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：稀效唑、6-BA和NAA配合使用能有效促進(jìn)浙江金線蓮類原球莖增殖，且不同的激素配比對(duì)類原球莖的增殖效果存在差異，其中第8號(hào)培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，為8.4。從極差R值(表4)可知，稀效唑?qū)︻愒蚯o的增殖起主要作用，其次為6-BA，影響最小的是NAA。根據(jù)K值大小可以得出，類原球莖增殖的最佳條件為稀效唑1.5 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。

圖2 浙江金線蓮類原球莖的增殖

表3 不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮類原球莖增殖的影響

表4 不同因素的極差分析

2.2.1 類原球莖的分化

對(duì)類原球莖進(jìn)行分化培養(yǎng)10 d左右，類原球莖球體頂部開始突起變尖、變綠，然后逐漸伸長(zhǎng)，分化出嫩芽，60 d后可分化成帶有莖節(jié)、葉片和幼小毛狀根的小苗(圖3)。對(duì)分化的類原球莖數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算分化率。結(jié)果如表5所示，不同的激素配比對(duì)類原球莖的分化效果產(chǎn)生不同影響。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加，分化率逐漸降低，例如，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1，NAA濃度為0.1、0.2、0.3 mg·L-1時(shí)，分化率分別為73.3%、65.3%、57.3%。當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，分化率逐漸降低，例如，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1，6-BA濃度為0.5、1.0、1.5 mg·L-1時(shí)，分化率分別為81.3%、65.3%、46.7%。因此，1號(hào)培養(yǎng)基的分化率最高，分化的最佳條件為6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。

圖3 浙江金線蓮類原球莖的分化培養(yǎng)

2.2.2 生根培養(yǎng)

分化的幼苗在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后開始有根長(zhǎng)出，生根培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)和植株生長(zhǎng)狀況，計(jì)算生根率，結(jié)果如表6所示。7種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)浙江金線蓮生根，且不同激素配比對(duì)生根效果的影響不同，其中1～6號(hào)培養(yǎng)基的生根率都達(dá)到了100%，但是從生根數(shù)、根長(zhǎng)等植株生長(zhǎng)整體狀況看，4號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況最好，平均根數(shù)為1.51條，根長(zhǎng)為1.53 cm，株高7.90 cm，莖節(jié)數(shù)6.50；7號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況最差，生根率僅為70%，株高、莖節(jié)數(shù)、平均根數(shù)等指標(biāo)均低于其他6組培養(yǎng)基。因此，浙江金線蓮生根培養(yǎng)的最佳條件為1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1。

表5 不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮類原球莖分化的影響

表6 培養(yǎng)60 d不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮生根的影響

累計(jì)培養(yǎng)120 d，再次觀察和統(tǒng)計(jì)植株生根狀況，結(jié)果如表7所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，根不斷增多變長(zhǎng)，植株不斷生長(zhǎng)。4號(hào)培養(yǎng)基和6號(hào)培養(yǎng)基中植株生長(zhǎng)狀況都較好，2組的平均株高、莖節(jié)數(shù)、根長(zhǎng)和根數(shù)均無顯著差異。7號(hào)培養(yǎng)基的平均株高、莖節(jié)數(shù)、根長(zhǎng)、根數(shù)和生根率也都有所增加，生根率達(dá)到92%，但相比其他幾組整體生長(zhǎng)狀況依然較差。

表7 培養(yǎng)120 d不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮生根的影響

累計(jì)培養(yǎng)180 d，再次觀察植株的生根狀況，結(jié)果如表8所示。7組植株間生長(zhǎng)狀況的差距逐漸減小，其中7號(hào)培養(yǎng)基中的植株的生根率達(dá)到了100%?？梢婋S著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生根率不斷增加，但其生長(zhǎng)狀況與其他組比依然較差。生長(zhǎng)狀況較好的為4號(hào)培養(yǎng)基和5號(hào)培養(yǎng)基。

表8 培養(yǎng)180 d不同激素濃度對(duì)浙江金線蓮生根的影響

綜合3次統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各培養(yǎng)基中金線蓮生根數(shù)不斷增多，根不斷變長(zhǎng)，平均株高不斷增長(zhǎng)，誘導(dǎo)率不斷升高，4號(hào)培養(yǎng)基上浙江金線蓮植株生長(zhǎng)狀況一直較好，7號(hào)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況則始終最差。可見最佳的生根培養(yǎng)條件為1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1，生根率可達(dá)100%。

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的植物激素配比可對(duì)浙江金線蓮類原球莖的誘導(dǎo)、增殖、分化和生根產(chǎn)生較大的影響。對(duì)類原球莖的誘導(dǎo)，在不同的培養(yǎng)基中，最佳激素配比不同。在液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)中最佳類原球莖誘導(dǎo)條件分別為TDZ 0.6 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1和TDZ 0.6 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1，誘導(dǎo)率分別為62.5%和59.3%。類原球莖增殖、分化、生根的最佳激素組合依次為：稀效唑1.5 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1，增殖系數(shù)、分化率、生根率分別為8.4、87.3%、100%，其中稀效唑是促進(jìn)類原球莖增殖的主要因子。

研究表明，可選用種子、莖段或頂芽作為外植體對(duì)金線蓮進(jìn)行快速繁殖，再生植株的途徑主要有叢生芽和原球莖(或類原球莖)，且類原球莖的增殖效率遠(yuǎn)高于叢生芽，更有利于金線蓮的快速繁殖[7-8]。本試驗(yàn)以浙江金線蓮莖段為材料進(jìn)行類原球莖的誘導(dǎo)，探討不同濃度激素配比對(duì)類原球莖誘導(dǎo)的影響；當(dāng)培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.6 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1時(shí)，類原球莖的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到62.5%。說明TDZ能促進(jìn)誘導(dǎo)類原球莖，這可能與TDZ具有很強(qiáng)的細(xì)胞分裂素(CTK)活性，可誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素的合成并抑制內(nèi)源生長(zhǎng)素的降解有關(guān)[6]。

外植體莖段的選擇與處理對(duì)誘導(dǎo)成功率有很大影響[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，幼嫩莖段的誘導(dǎo)率高于粗壯老莖段。未切除葉片、嫩芽或氣生根的莖段材料極難誘導(dǎo)成功，推測(cè)原因可能是莖段吸收的營(yíng)養(yǎng)大部分用于葉片、芽和根的生長(zhǎng)，類原球莖誘導(dǎo)產(chǎn)生所需營(yíng)養(yǎng)不足，而很難發(fā)生。因此，建議在做類原球莖誘導(dǎo)時(shí)應(yīng)切除上述器官。另外，對(duì)于幼嫩莖段，應(yīng)適當(dāng)增加外植體的莖節(jié)數(shù)，避免因過分切割導(dǎo)致材料的褐化死亡。

金線蓮類原球莖增殖培養(yǎng)時(shí)，稀效唑是類原球莖增殖的主要因子，其作用超過6-BA和NAA[6]。稀效唑可抑制赤霉素的生物合成，具有促進(jìn)分化、抑制植物生長(zhǎng)的作用，加入烯效唑有利于提高增殖效率[6]。本研究結(jié)果也表明，稀效唑?qū)φ憬鹁€蓮類原球莖的增殖具有類似的作用。

在類原球莖的分化研究中，6-BA和NAA是常用的植物激素。本研究發(fā)現(xiàn)較低濃度的6-BA更有利于類原球莖的分化，且6-BA/NAA激素比值較低有利于分化。前人研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA濃度過高不利于芽叢發(fā)生，本研究結(jié)果與此一致[10]。隨著激素濃度的升高，激素對(duì)植物的促進(jìn)作用先升高后降低，并非6-BA、NAA激素濃度越低越利于分化，只是在本試驗(yàn)所選取的激素濃度范圍內(nèi)低濃度更利于植株分化，但是否為分化的最佳濃度有必要在今后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。有研究表明，在培養(yǎng)基中添加添加物對(duì)細(xì)胞組織的增殖和分化有明顯的促進(jìn)作用[11-12]，香蕉泥中含有大量的糖類，可為植物組織細(xì)胞分裂分化提供能源，同時(shí)，在香蕉泥中含有天然激素如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、乙烯和赤霉素等多種活性物質(zhì)，此外，香蕉泥還具有較好的pH緩沖作用，在蘭花(Cymbidiumspp.)離體培養(yǎng)中應(yīng)用較多[8]，常用濃度為100～200 mg·L-1。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加香蕉泥，瓶苗粗壯，根系發(fā)達(dá)，更利于分化[8]。本研究在分化培養(yǎng)基添加10%的香蕉泥，能促進(jìn)植株分化生長(zhǎng)。

培養(yǎng)基中大量元素含量較低時(shí)更加利于組培苗生根[13]，相對(duì)于MS培養(yǎng)基而言，1/2 MS培養(yǎng)基中的大量元素減半，更有利于組培苗的生根。因此，本試驗(yàn)選用1/2 MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，促進(jìn)浙江金線蓮的生根培養(yǎng)。結(jié)果表明，IBA和NAA配合使用能有效促進(jìn)浙江金線蓮生根，不同激素配比對(duì)浙江金線蓮生根效果的影響各不相同，IBA和NAA濃度過高過低都不是最佳誘導(dǎo)生根條件，浙江金線蓮根對(duì)IBA和NAA的響應(yīng)符合植物對(duì)激素濃度的反應(yīng)情況，得到了與金線蓮生根培養(yǎng)一致的結(jié)果[4]。