中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥病理學診斷及兩種病原的檢測

劉力碩，楊宗英，胡 鯤，楊先樂

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306；2.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.上海海洋大學農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；4.南昌市農(nóng)業(yè)科學院，南昌 330038)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)養(yǎng)殖業(yè)是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來，江蘇省中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，2014年江蘇省河蟹總產(chǎn)值達40億美元[1]，然而養(yǎng)殖迅猛發(fā)展的同時病害問題也愈演愈烈，2015年和2016年江蘇省興化市暴發(fā)了中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥，俗稱“水癟子”，造成總產(chǎn)量損失達40%～50%[2]，2017年雖呈現(xiàn)稍緩態(tài)勢，但仍威脅著我國河蟹產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。早在2001年，東太湖已發(fā)現(xiàn)類似疾病[3]，但一直未得到足夠的關(guān)注。目前尚未有學者詳細描述該病各典型癥狀的變化過程，對完整病程中各階段的劃分也存在不足，該病的病原仍存在爭論，主要集中于微孢子蟲[2]、白斑綜合征病毒(WSSV)[4]和非生物因素[3，5～6]。為探究以上問題，實驗在江蘇省興化市采集80只該病病蟹，從中選取處于不同患病階段共12只，進行組織病理學研究和微孢子蟲、WSSV兩種病原的檢測，系統(tǒng)地闡述了該病各典型癥狀的變化過程，并創(chuàng)新地依據(jù)肝小管病變程度，將完整病程劃分為4個時期，最后對病原檢測結(jié)果進行討論分析，為中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥提供臨床診斷和預防的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2018年4-6月，于江蘇省泰州市興化市采集患中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合征病蟹共80只(50～100 g),為全面了解該病各時期的病理變化，挑選處于該病各階段且具有所處階段典型癥狀的病蟹，共12只(1～12號)，分別采集這12只病蟹的肝胰腺、肌肉和鰓組織于波恩氏液中固定24 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇中于4 ℃下保存，用于制作組織病理切片，同時采集肝胰腺和肌肉組織于-80 ℃下保存，用于病原檢測實驗。

1.2 實驗方法

病蟹活體剖檢觀察：活體解剖病蟹(1～12號)，觀察體表及各內(nèi)臟器官的病變情況，與健康蟹進行比較，以確定該病的主要病變規(guī)律和病變器官，采集圖片并做出臨床解剖診斷。

組織病理學切片制備和觀察：將所保存的組織用銳利手術(shù)刀修整為長5 mm寬2 mm高1 mm左右的組織塊，經(jīng)過體積分數(shù)70%～100%的乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機切片(厚度5 μm)、H.E.染色、中性樹膠封片制成組織病理切片，在奧林巴斯高級攝像顯微鏡(BX51/DP72)下觀察拍照。

巢式PCR檢測WSSV：利用巢式PCR技術(shù)檢測病蟹肝胰腺和肌肉組織中的WSSV。PCR引物序列參照文獻[7]，PCR反應程序參照文獻[8]。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂凝膠上進行電泳，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

常規(guī)PCR檢測微孢子蟲：利用常規(guī)PCR技術(shù)檢測病蟹肝胰腺和肌肉組織。PCR引物序列及PCR反應程序參照文獻[2]。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂凝膠上進行電泳，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 病蟹剖檢觀察的臨床癥狀

肝胰腺癥狀表現(xiàn)：與健康河蟹肝胰腺(圖版Ⅰ-1)對比，發(fā)現(xiàn)1～3號病蟹肝胰腺明顯增生、腫大(圖版Ⅱ-1)，同時，腺體因體積增大，出現(xiàn)向泄殖腔拓張的癥狀(圖版Ⅱ-2、3)；4～6號病蟹肝胰腺出現(xiàn)黃色與白色肝小管交錯的癥狀(圖版Ⅱ-4～6)；7～9號病蟹肝胰腺出現(xiàn)肝小管全部白化的癥狀(圖版Ⅱ-7～9)；10～12號病蟹肝胰腺出現(xiàn)嚴重萎縮、粘液增多、渾濁、半透明、粥樣的特征(圖版Ⅱ-10～12)。

鰓部癥狀表現(xiàn)：6、12號病蟹鰓部變黑(圖版Ⅱ-6、12)；1、5、9、10號病蟹鰓部顏色變暗(圖版I-1、5、9、10)。

副肢癥狀表現(xiàn)：副肢均無力，甲殼變薄、脆，易被外力(如：手指按壓)造成形變。

綜上所述，肉眼可見的肝胰腺白化、萎縮，鰓絲顏色變深，副肢無力、變軟，腹腔積水為該病的臨床癥狀。

2.2 病蟹的組織病理變化

2.2.1 肝胰腺組織病理變化

與健康河蟹肝胰腺組織切片(圖版Ⅰ-2)對比，發(fā)現(xiàn)12只病蟹的肝小管上皮細胞均有不同程度的病變及損傷，體現(xiàn)出該病病程中不同階段的病理特征。1～3號病蟹的肝小管上皮細胞大量增生，病變?yōu)閰^(qū)別于健康肝小管單層上皮細胞的多層上皮細胞(圖版Ⅲ-1～3)；4～6號病蟹肝胰腺中的部分肝小管空泡化，與正常肝小管交錯分布(圖版Ⅲ-4～6)，4號病蟹空泡化的肝小管上皮細胞輕度溶解(圖版Ⅲ-4)；7～9號病蟹的全部肝小管均重度空泡化(圖版Ⅲ-7～9)；10～12號病蟹的全部肝小管上皮細胞均嚴重溶解(圖版Ⅲ-10～12)。肝胰腺組織在該病發(fā)展過程中的不同階段體現(xiàn)出規(guī)律的病理變化特征，其病變癥狀對該病診斷起最重要作用。

2.2.2 鰓組織病理變化

與健康河蟹鰓組織切片(圖版Ⅰ-3)對比，發(fā)現(xiàn)12只病蟹的鰓組織細胞結(jié)構(gòu)完整，僅局部鰓弓和個別鰓小葉發(fā)生病變，1～3以及6號病蟹鰓弓和鰓小葉不同程度充血(圖版Ⅳ-1～3、6)。1、2、5、6號病蟹嗜酸性粒細胞有不同程度的浸潤(圖版Ⅳ-1、2、5、6)。4～10以及12號病蟹鰓部多處不同程度水腫，其中9號病蟹鰓小葉上皮細胞融合(圖版Ⅳ-4～10、12)。鰓部并未呈現(xiàn)出規(guī)律性的病理變化，病理癥狀種類各異，個體差異性較大，多與其生長水體的水質(zhì)情況差異性有關(guān)，如：理化因子含量、渾濁度、pH等，亦可能因患病個體抵抗力下降，繼而被病毒、真菌、細菌、寄生蟲等侵染所致。

2.2.3 肌肉組織病理變化

與健康河蟹肌肉組織切片(圖版Ⅰ-2)對比，發(fā)現(xiàn)隨著12只病蟹肝胰腺病變的加劇，肌肉組織也呈現(xiàn)出愈發(fā)嚴重的萎縮(圖版Ⅴ-1～12)，同時個別部位出現(xiàn)嗜堿性粒細胞浸潤的病理癥狀(圖版Ⅴ-1、6、9)，最終病蟹肌肉嚴重萎縮部位被結(jié)締組織的增生所取代(圖版Ⅳ-10～12)。

2.3 病蟹肝胰腺中微孢子蟲和WSSV的PCR結(jié)果

微孢子蟲檢測的擴增片段預期大小為931 bp，白斑綜合征病毒(WSSV)檢測的擴增片段預期大小為982 bp，陽性目標條帶均出現(xiàn)在1 000 bp分子標準的下方。

12只病蟹肝胰腺和肌肉組織中微孢子蟲的檢測結(jié)果顯示，4～7號病蟹肝胰腺組織檢測呈陽性(圖1-A)，肌肉組織檢測全部呈陰性(圖1-B)，統(tǒng)計(表1)顯示，4只病蟹肝胰腺檢測結(jié)果呈陽性，肌肉檢測結(jié)果全部呈陰性。

圖1 肝胰腺和肌肉組織寄生微孢子蟲的PCR檢測結(jié)果Fig.1 Results detected by conventional PCR of hepatopancreas and muscle parasitized by microsporidian M：DL2000分子質(zhì)量標準;A:肝胰腺組織中微孢子蟲檢測；B：肌肉組織中微孢子蟲的檢測。

樣品肝胰腺肌肉樣 品肝胰腺肌肉1--7+-2--8--3--9--4+-10--5+-11--6+-12--

注：+ 為陽性結(jié)果；- 為陰性結(jié)果。

12只病蟹肝胰腺和肌肉組織WSSV檢測結(jié)果顯示，僅12號呈陰性(圖2-A)，肌肉組織檢測中僅3、12號呈陰性(圖2-B)。統(tǒng)計(表2)顯示，11只病蟹肝胰腺檢測呈陽性，10只病蟹肌肉檢測呈陽性。

圖2 肝胰腺和肌肉組織中WSSV的PCR檢測結(jié)果Fig.2 Results detected by conventional PCR of hepatopancreas and muscle infected by WSSV M：DL2000分子標準；P：陽性對照；N:陰性對照；A:病蟹肝胰腺組織中WSSV檢測；B：病蟹肌肉組織中WSSV的檢測

樣 品肝胰腺肌肉樣 品肝胰腺肌肉1++7++2++8++3+-9++4++10++5++11++6++12--

注：+ 為陽性結(jié)果；- 為陰性結(jié)果。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥癥狀及產(chǎn)生過程

實驗結(jié)果以2個病理特征診斷中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥：(1)肝胰腺的肝小管出現(xiàn)上皮細胞增生、黃白肝、白化、粥樣化癥狀之一。(2)副肢軟化、肌肉萎縮、局部白濁。

目前，楊宗英等[9]已對肝胰腺顏色變化機理進行了充分的闡釋，本研究則重點針對肝胰腺自肥大到壞死萎縮、肌肉萎縮和腹腔積水等典型癥狀的變化過程及其關(guān)聯(lián)進行描述。首先肝胰腺作為該病完整周期中的主要病變器官，呈現(xiàn)出先增生、功能增強而后器官衰竭、壞死、萎縮的變化特點，推測這種病理變化是由于致病因子導致肝胰腺機能負擔增加，作為反應，肝胰腺在病理條件下發(fā)生肥大、肝小管上皮細胞增生，器官功能增強，但儲備力卻相對降低，屬于典型的代償性肥大[10]，當肝胰腺的機能負擔超過其代償限度時，造成器官功能不全，肝小管上皮細胞空泡增多、壞死、溶解，肝胰腺逐步衰竭，無法儲存營養(yǎng)物質(zhì)，同時病蟹食欲減弱、食物攝入量嚴重不足，機體通過分解肌肉組織以補充能量供應，最終造成肝胰腺和副肢肌肉嚴重萎縮，由于中華絨螯蟹的循環(huán)系統(tǒng)屬開管系統(tǒng)，導致腹腔內(nèi)大量血液堆積以填充肝胰腺萎縮的空間，因此出現(xiàn)腹腔積液的癥狀。

3.2 中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥的四個發(fā)展階段及命名

目前，已有學者依據(jù)肝胰腺顏色變化將該病劃分為淺黃、淺粉、乳白和灰白四個階段[11]，但這種依靠肝胰腺顏色劃分發(fā)病階段的方法存在以下三點不足：第一，未包含肝胰腺增生這一發(fā)病階段；第二，肝小管的白化并不同步，是逐個白化，存在黃、白肝小管交錯的時期，依據(jù)肝胰腺顏色進行劃分則無法體現(xiàn)這一階段特點；第三，肝胰腺呈現(xiàn)淺粉、乳白色時，肝小管已完全白化，應當屬于同一發(fā)病階段。結(jié)合病蟹剖檢觀察及組織病理觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)可根據(jù)肝小管病變特點，將中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥的完整病程劃分為以下四個時期。

Ⅰ期：肝胰腺增生期，此階段病蟹臨床解剖表現(xiàn)為肝胰腺腫大，顏色正常，因腺體體積增大而向泄殖腔拓張(圖版Ⅱ-2、3)。組織病理顯示，肝小管上皮細胞有明顯的增生現(xiàn)象，即出現(xiàn)多層上皮細胞，區(qū)別于健康的單層柱狀上皮細胞；此時期副肢肌肉萎縮較輕。

Ⅱ期：部分肝小管白化期，此階段為Ⅰ期和Ⅲ期之間的過渡期，病蟹臨床解剖表現(xiàn)為增生期肝小管與白化期肝小管交錯分布。組織病理顯示，Ⅰ期和Ⅲ期肝小管交錯分布；此時期副肢肌肉輕度萎縮。

Ⅲ期：肝小管完全白化期，此階段病蟹臨床解剖表現(xiàn)為肝胰腺徹底白化或白中透著微黃，肉眼觀察為純白色或淡粉色，但腺體還未發(fā)生嚴重萎縮現(xiàn)象；組織病理顯示，肝小管柱狀上皮細胞的細胞質(zhì)嚴重空泡化，空泡占比65%以上；此時期副肢肌肉萎縮較重。

Ⅳ期：肝胰腺壞死期，此階段病蟹臨床解剖表現(xiàn)為病蟹肝胰腺明顯萎縮，肝小管粘連、呈粥樣的半透明糊狀；組織病理顯示，肝小管上皮細胞出現(xiàn)崩解、自溶的現(xiàn)象，柱狀上皮細胞結(jié)構(gòu)不完整，但肝小管管壁并未破損；此時期副肢肌肉萎縮嚴重。

3.3 中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥致病因子的分析

實驗結(jié)果顯示，僅有33.3%的病蟹肝胰腺中檢測出微孢子蟲，因此，微孢子蟲作為中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥病原的可能性較小。WSSV在病蟹肝胰腺和肌肉組織中的檢出率為91.7%和83.3%，但WSSV為高毒性病毒，有研究表明，健康中華絨螯蟹經(jīng)過人工感染W(wǎng)SSV 96 h后的存活率不足20%[12]，同時實際生產(chǎn)中發(fā)生白斑綜合癥的河蟹養(yǎng)殖池塘存在大量病蟹死亡的現(xiàn)象，與肝胰腺壞死癥死亡率低的特點不符，同時肝胰腺壞死綜合征病蟹雖感染白斑綜合征病毒卻未引發(fā)相應癥狀，推測是由于病蟹體內(nèi)的WSSV濃度較低，未達到引起疾病癥狀產(chǎn)生的最低病毒濃度，故認為病蟹作為WSSV攜帶者的可能性較大，而WSSV作為肝胰腺壞死癥致病因子的可能性較小。

依據(jù)采集病蟹樣品期間的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病池塘在當年4月底殺蟲作業(yè)時，均存在嚴重的阿維菌素濫用情況，用量超使用說明劑量5～10倍，5月中旬即出現(xiàn)處于肝胰腺壞死病早期的個體，結(jié)合該病早期具有肝胰腺代償性肥大癥狀，不排除有毒素致病的可能性，有研究表明[13]，阿維菌素亞致死暴露下，河蟹肝胰腺中乳酸脫氫酶(LDH)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性顯著降低，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性呈現(xiàn)先顯著提高而后逐步降低的趨勢，其中LDH參與有氧氧化和糖類代謝，并發(fā)揮重要作用[14],其活性的改變會造成糖類代謝異常，抑制機體供能，進一步造成器官損傷，在一定程度上更敏感地反映臟器的功能狀況[15]，AChE的活性與沖動傳導、神經(jīng)細胞的能量代謝等重要生理過程有關(guān)[16]，GSTs是一種參與機體解毒的酶，通過提高谷胱甘肽(GSH)合成，增強機體清除脂質(zhì)過氧化物自由基的能力。這項研究顯示健康河蟹在阿維菌素誘導下，肝胰腺排毒功能先增強后衰弱、營養(yǎng)代謝功能持續(xù)衰退的特點，與中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥初期肝胰腺代償性肥大，后期器官衰竭的特點具有相似性，同時也為該病的進一步研究提供了思路，因此，實驗結(jié)果更加傾向于支持非生物因素作為該病致病因子的觀點，但仍需對四個病理時期肝胰腺中LDH、AChE和GSTs三種酶作進一步研究，同時也需要采用實際生產(chǎn)中藥物濫用劑量，對健康中華絨螯蟹進行中長期持續(xù)誘導的實驗加以驗證。

圖版Ⅰ 健康中華絨螯蟹
Plate.Ⅰ Healthy ChineseE.sinensis
1.健康河蟹解剖圖；2.健康河蟹肝胰腺組織石蠟切片；3.健康河蟹鰓組織石蠟切片；4.健康河蟹肌肉組織石蠟切片。

圖版Ⅱ 病蟹解剖圖
Plate.Ⅱ Anatomical drawning of sick crabs 1.1號病蟹 肝胰腺腫大、增生(H)；2.2號病蟹 肝胰腺腫大，腺體有向泄殖腔拓張的趨勢(E)；
3.3號病蟹 肝胰腺嚴重腫大，出現(xiàn)腺體向泄殖腔拓張的癥狀(E)；4～5.4、5號病蟹 部分肝小管白化(W)，黃、白肝小管交錯；6.6號病蟹 少量肝小管白化(W)，鰓絲嚴重變黑(B)；7～9.7～9號病蟹 肝小管全部白化(W)；
10.10號病蟹 肝胰腺粥樣病變、重度萎縮(A)，少量腹水(as)；11.11號病蟹 肝胰腺粥樣病變、重度萎縮
(A)；12.12號病蟹 肝胰腺粥樣病變、嚴重萎縮(A)，腹水較多(as)，鰓絲變黑(B)。

圖版Ⅲ 病蟹肝胰腺組織病理
Plate.Ⅲ Histopathology of hepatopancreas in sick crabs
1～3.1～3號病蟹 肝小管上皮細胞增生(H)；4.4號病蟹 白化肝小管空泡化(V)，細胞溶解(D)，未白化的肝小管，上皮細胞增生(H)；5～6.5、6號病蟹 白化肝小管空泡化(V)，肝小管上皮細胞少量增生
(H)；7～9.7～9號病蟹 肝小管上皮細胞空泡化嚴重(V)；10～12.10～12號病蟹 肝小管上皮細胞溶解(D)。

圖版Ⅳ 病蟹鰓組織病理
Plate.Ⅳ Histopathology of gill in sick crabs
1.1號病蟹 鰓絲、鰓弓充血(hy)，嗜酸性粒細胞(eo)和嗜堿性粒細胞(bg)浸潤；2.2號病蟹 鰓小葉尖端充血(hy)，嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；3.3號病蟹 鰓弓充血(hy)；4.4號病蟹 鰓小葉尖端水腫(ed)；5.5號病蟹 鰓小葉水腫(ed)，嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；6.6號病蟹 鰓小葉充血(hy)、水腫(ed)，嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；7～8.7、8號病蟹 鰓小葉輕微水腫
(ed)；9.9號病蟹 鰓小葉嚴重水腫(ed)、上皮細胞融合(an)、嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；10.10號病蟹 鰓弓水腫(ed)；
11.11號病蟹 鰓小葉尖部萎縮(A)；12.12號病蟹 鰓小葉尖部萎縮(A)、水腫(ed)。

圖版V 病蟹肌肉組織病理
Plate.V Histopathology of muscle in sick crabs
1.1號病蟹 肌肉萎縮較輕(A)，嗜堿性粒細胞浸潤(bg)；2～5.2～5號病蟹 肌肉萎縮較輕(A)；6.6號病蟹 肌肉輕度萎縮(A)，嗜堿性粒細胞浸潤(bg)；7～8.7、8號病蟹 肌肉重度萎縮(A);9.9號病蟹 肌肉萎縮較輕(A)、
嗜堿性粒細胞浸潤(bg)；10～12.10～12號病蟹 肌肉重度萎縮(A)，結(jié)締組織增多(S)。