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    團(tuán)頭魴NOS2基因的克隆和組織表達(dá)分析

    2019-09-23 03:54:56王玉青鄔長(zhǎng)松馬潔樂陳會(huì)杰劉小玲
    淡水漁業(yè) 2019年5期
    關(guān)鍵詞:團(tuán)頭魴水氣草魚

    王玉青,鄔長(zhǎng)松,馬潔樂,陳會(huì)杰,劉小玲

    (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)系,湖北省水生動(dòng)物病害防控工程技術(shù)研究中心,水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,武漢 430070)

    一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的關(guān)鍵酶,具有催化L-精氨酸氧化生成L-瓜氨酸和一氧化氮的功能。根據(jù)NOS的來(lái)源及催化特性的不同,可將其分為神經(jīng)型NOS(neuronal nitric oxide synthase,nNOS或NOS1)、誘導(dǎo)型NOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS或NOS2)和內(nèi)皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase,eNOS或NOS3)三種亞型[1-3]。1989年,NOS2被首次報(bào)道[4],目前普遍認(rèn)為,NOS2主要存在于巨噬細(xì)胞中,也存在于肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和各種腫瘤細(xì)胞內(nèi)。NOS2是二聚體,每一個(gè)亞基都含有兩個(gè)區(qū)域,一個(gè)區(qū)域是包含亞鐵血紅素和四氫生物蝶呤的氧化區(qū),另一個(gè)區(qū)域是結(jié)合FAD、FMN和NADPH的還原區(qū)。當(dāng)生物體受到細(xì)菌等外界因素或內(nèi)源性炎癥細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)的刺激后,NOS2被誘導(dǎo)表達(dá),隨后催化合成大量的NO,產(chǎn)生的NO可參與多種免疫調(diào)節(jié)過(guò)程,具有殺菌、抗病毒和抗寄生蟲等多種免疫效應(yīng)[5]。

    團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala),俗稱武昌魚,我國(guó)特有的淡水鯉科魚類。近年來(lái)細(xì)菌病的暴發(fā),導(dǎo)致大量的團(tuán)頭魴死亡,從而給團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)造成極大損失。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是公認(rèn)的感染魚類的重要病原菌,屬于弧菌科氣單胞菌屬,是典型的人畜魚共患病病原[6]。2010年,田甜等[7]報(bào)道嗜水氣單胞菌可引起團(tuán)頭魴急性出血性敗血癥。細(xì)菌性敗血癥對(duì)養(yǎng)殖魚類危害最重,暴發(fā)傳播的速度極快,患病魚死亡率很高[8]。在敗血癥過(guò)程中,致炎因子和內(nèi)毒素可引起多種細(xì)胞和組織中NOS2的表達(dá),從而產(chǎn)生大量的NO,過(guò)量的NO會(huì)造成細(xì)胞和組織損傷。

    劉立等[9]研究證明,殼寡糖(chtiosanoligosaccharide,COS)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可以激活團(tuán)頭魴的巨噬細(xì)胞,上調(diào)NOS2的表達(dá),增加NOS2的酶活,提高活性氮的表達(dá)水平。然而,病原菌感染團(tuán)頭魴時(shí)NOS2基因的組織表達(dá)水平及調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)克隆了團(tuán)頭魴NOS2基因的全長(zhǎng)cDNA序列,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后NOS2基因在肝臟、脾臟、頭腎和腸中的表達(dá)變化,旨在探究NOS2在團(tuán)頭魴個(gè)體免疫中發(fā)揮的作用,為后續(xù)研究其在細(xì)菌感染后的免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    本研究所用團(tuán)頭魴體重為400 g左右,購(gòu)自湖北百榮水產(chǎn)良種有限公司,于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)基地淡水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)兩周,待供試魚適應(yīng)環(huán)境,并確認(rèn)無(wú)疾病癥狀后,用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間水溫控制在25~26 ℃,水源為充分曝氣的自來(lái)水,使用充氣泵24 h不間斷充氧,每天分兩次投喂(8∶00,17∶00),每次投喂相當(dāng)于魚體重1.5%的人工配合飼料(武漢海大飼料有限公司生產(chǎn))。

    病原:供試菌株為筆者所在研究室保存的嗜水氣單胞菌(AhJ-1株系),該株系為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。將菌株接種在LB液體培養(yǎng)基(1 L培養(yǎng)液中,含酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,蛋白胨10 g,調(diào)節(jié)pH至7.4)中,28 ℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng),離心收集細(xì)菌,磷酸鹽平衡鹽溶液(PBS)洗滌三次,調(diào)整菌液濃度為3×107CFU/mL,作為攻毒菌液備用。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 總RNA的提取

    解剖3尾健康團(tuán)頭魴,取頭腎30~50 mg,根據(jù)總RNA提取試劑盒RNAiso Plus (TAKARA)的操作說(shuō)明,提取總RNA。用微量核酸測(cè)定儀NanoDrop 2000測(cè)定RNA的純度及濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑按照既定步驟反轉(zhuǎn)錄得到cDNA (PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,TAKARA)。

    1.2.2 團(tuán)頭魴NOS2基因cDNA片段的克隆

    根據(jù)草魚NOS2基因的序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增團(tuán)頭魴的中間序列,根據(jù)中間序列設(shè)計(jì)特異性引物,以團(tuán)頭魴頭腎cDNA為模板,按照Takara公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒,擴(kuò)增NOS2基因的3′和5′端,將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α(全式金,北京)中,選取陽(yáng)性克隆的菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

    1.2.3 生物信息學(xué)分析

    用DNASTAR軟件對(duì)測(cè)序后獲得的序列進(jìn)行拼接,得到NOS2的cDNA全長(zhǎng)。采用在線BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)NOS2的cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行同源性檢索。使用ExPASy網(wǎng)站(https://www.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)氨基酸序列并且分析氨基酸序列的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和功能結(jié)合位點(diǎn)。使用clustalX軟件進(jìn)行多重序列比較,同時(shí)用MEGA6.0(Neighbor-Joining,NJ法)構(gòu)建進(jìn)化樹。

    1.2.4 嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后NOS2基因的表達(dá)變化

    魚體感染和取樣參照Liu等[10]的方法并稍加改動(dòng),選取健康的團(tuán)頭魴50尾,隨機(jī)分為2組,實(shí)驗(yàn)組注射100 μL上述菌液,對(duì)照組注射等量的PBS。在注射后0、3、6、12、24、48、72 h取樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)選取3尾活魚,抽取血液后,解剖分離出30~50 mg左右的肝臟、脾臟、頭腎和腸,分別放入加有1 mL預(yù)冷Trizol的1.5 mL的EP管中,凍存于-80 ℃冰箱。所有樣品取完后,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用熒光定量PCR對(duì)NOS2基因進(jìn)行表達(dá)分析。反應(yīng)程序:預(yù)變性95 ℃ 10 min,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min,40個(gè)循環(huán);溶解曲線從65 ℃到95 ℃。qPCR反應(yīng)在羅氏480熒光定量PCR儀上進(jìn)行,每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)定3組重復(fù),以NOS2基因mRNA在不同組織中的表達(dá)量與β-actin的表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比,作NOS2基因的相對(duì)表達(dá)量的分析,相對(duì)定量分析采用2-ΔΔCT法[11]。為了方便觀察NOS2基因在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量,本實(shí)驗(yàn)將0h的NOS2的相對(duì)表達(dá)量的值設(shè)定為1。用SPSS16.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 團(tuán)頭魴NOS2基因cDNA全長(zhǎng)及序列特征

    PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序之后,得到的序列經(jīng)過(guò)DNAstar軟件拼接,除去重疊序列和接頭序列,最后得到團(tuán)頭魴NOS2的cDNA全長(zhǎng)(所用引物見表1)。使用在線BLAST對(duì)獲得的序列和已報(bào)道的NOS2序列進(jìn)行同源性分析,該序列與草魚和斑馬魚的NOS2序列全長(zhǎng)相似性大于80%,說(shuō)明得到的序列為團(tuán)頭魴NOS2。核苷酸序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),序列登錄號(hào)為KJ668755。團(tuán)頭魴NOS2的cDNA序列全長(zhǎng)4 215 bp,5′非編碼區(qū)為197 bp,3′非編碼區(qū)為775 bp,開放閱讀框?yàn)? 243 bp,編碼1 080個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子質(zhì)量約為122.51 kW,理論等電點(diǎn)為7.36。使用clustalX軟件對(duì)團(tuán)頭魴、草魚、斑馬魚、墨西哥脂鯉和虹鱒的序列進(jìn)行多重序列比對(duì),使用ExPASy網(wǎng)站在線分析其功能結(jié)合位點(diǎn)。如圖1所示,參與比對(duì)的序列N-末端都具有Heme、BH4和CAM結(jié)合位點(diǎn),C-末端都具有FMN、FAD和NADPH結(jié)合位點(diǎn),這些區(qū)域在硬骨魚類中高度保守。

    表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in these experiments

    圖1 團(tuán)頭魴NOS2的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of the NOS2 amino acid sequencesNOS2的保守一致序列用彩色陰影標(biāo)示,缺失的氨基酸殘基用破折號(hào)表示,下劃線標(biāo)示輔因子的結(jié)合位點(diǎn)

    2.2 團(tuán)頭魴NOS2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

    為了得到團(tuán)頭魴NOS2的進(jìn)化信息,從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取33個(gè)NOS2的蛋白序列,將其進(jìn)行BLAST分析。用MEGA 6.0(Neighbor-Joining,NJ法)對(duì)33個(gè)NOS2的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。脊椎動(dòng)物的NOS分成NOS1、NOS2、NOS3三個(gè)分支,其中NOS1和NOS3與無(wú)脊椎動(dòng)物的NOS的親緣關(guān)系更近。團(tuán)頭魴與草魚、斑馬魚、鯉和金魚聚為鯉形目的一簇,其中團(tuán)頭魴的NOS2與草魚的NOS2親緣關(guān)系最近。9個(gè)魚類的NOS2組成了硬骨魚類的分支,同時(shí)與哺乳類、鳥類和爬行類聚為脊椎動(dòng)物NOS2分支。

    圖2 團(tuán)頭魴NOS2和其它動(dòng)物的NJ分子進(jìn)化樹Fig.2 NJ-phylogenetic tree of the NOS2 gene constructed by using amino acid sequences團(tuán)頭魴NOS2用▲標(biāo)出。節(jié)點(diǎn)處數(shù)值為自展置信值,自展重復(fù)1 000次,進(jìn)化樹分析所用蛋白見表2

    2.3 團(tuán)頭魴NOS2基因在嗜水氣單胞菌感染后的表達(dá)變化

    團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌至72 h,各組團(tuán)頭魴均無(wú)死亡。不同組織NOS2的表達(dá)水平如圖3所示,在肝臟組織中,NOS2在感染后3 h表達(dá)量極顯著上調(diào),出現(xiàn)峰值,12 h顯著下調(diào),隨后顯著上調(diào),并且在48 h出現(xiàn)第二個(gè)峰值。在脾臟組織中,NOS2在感染后3 h表達(dá)量極顯著上調(diào),出現(xiàn)峰值,6 h顯著下調(diào),其余時(shí)間點(diǎn)極顯著下調(diào)表達(dá)。在頭腎組織中,NOS2在注射后3 h表達(dá)量達(dá)到最高,出現(xiàn)峰值,12 h恢復(fù)到注射前水平,在其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均是極顯著上調(diào)。在腸道組織中,NOS2在3 h極顯著下調(diào)表達(dá),6 h顯著上調(diào)表達(dá),24 h顯著下調(diào)表達(dá)。

    圖3 嗜水氣單胞菌感染后,團(tuán)頭魴肝臟、脾臟、頭腎和腸中NOS2在mRNA水平的表達(dá)變化Fig.3 Changes of relative mRNA expression levels of the NOS2 in the liver,spleen,head-kidney and intestine of M.amblycephala after challenged with A.hydrophila

    3 討論

    本研究通過(guò)同源克隆和RACE技術(shù)獲得團(tuán)頭魴NOS2的cDNA全長(zhǎng),預(yù)測(cè)蛋白分子量為122.51 KW,等電點(diǎn)7.36。氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果表明,團(tuán)頭魴的NOS2與草魚的NOS2和斑馬魚的NOS2b的相似度較高。氨基酸序列分析表明,NOS2的N-末端都具有Heme、BH4和CAM結(jié)合位點(diǎn),C-末端都具有FMN、FAD和NADPH結(jié)合位點(diǎn),與汪新艷等[12]在草魚上的研究結(jié)果一致。進(jìn)化分析表明,團(tuán)頭魴的NOS2在進(jìn)化關(guān)系上與草魚的NOS2最接近,與硬骨魚類的NOS2聚為一支,共同構(gòu)成脊椎動(dòng)物的NOS2分支,說(shuō)明不同種屬的NOS2的異構(gòu)體具有高度的同源性;團(tuán)頭魴NOS2與脊椎動(dòng)物NOS1和NOS3以及無(wú)脊椎動(dòng)物NOS的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),進(jìn)一步證實(shí)我們克隆的基因是NOS2。

    在病原菌刺激時(shí),不同物種、不同組織的NOS2表達(dá)變化存在差異[13-14]。本研究用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后NOS2在肝臟、頭腎、脾臟和腸道的表達(dá)變化。在肝臟中,NOS2在感染早期表達(dá)量極顯著上調(diào),12 h顯著下調(diào),隨后顯著上調(diào)。然而,Yao等[15]研究發(fā)現(xiàn),凡納濱對(duì)蝦注射LPS后,NOS基因在肝胰腺中表達(dá)量顯著降低,可能是不同物種間的免疫系統(tǒng)存在差異性。肝臟參與魚類的非特異性免疫反應(yīng),在細(xì)菌脂多糖、細(xì)胞因子等的誘導(dǎo)下,肝細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞和貯脂細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)NOS2[16]。溫振才[17]用嗜水氣單胞菌刺激鯉魚后檢測(cè)的NOS2組織表達(dá)情況表明,NOS2在頭腎中的表達(dá)量最高。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)嗜水氣單胞菌刺激的團(tuán)頭魴的組織表達(dá)情況表明,NOS2在頭腎中亦被大量誘導(dǎo)表達(dá)。頭腎是魚類重要的免疫器官,當(dāng)受到外來(lái)病原體感染時(shí),頭腎中的免疫細(xì)胞如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖分化,大量表達(dá)NOS2,進(jìn)而產(chǎn)生大量NO來(lái)對(duì)抗入侵的微生物[18-19]。在脾臟中NOS2在3 h上調(diào)表達(dá),其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均顯著下調(diào)。郭建等[20]采用捕食應(yīng)激模式,發(fā)現(xiàn)大鼠脾臟NOS2活性程度與動(dòng)物心理應(yīng)激程度密切相關(guān),應(yīng)激過(guò)程中NOS2活性增加,應(yīng)激后期NOS2的活性又逐漸降低。因此推測(cè)脾臟NOS2早期的上調(diào)表達(dá)可能是團(tuán)頭魴對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。在腸道組織中NOS2基因除了在6 h有微弱的上調(diào)表達(dá)之外,總體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。對(duì)大鼠腸道的研究表明,NOS2的表達(dá)水平與腸道病理?yè)p傷指數(shù)呈顯著正相關(guān)關(guān)系;調(diào)節(jié)NOS2活性,減少NO生成量,可減輕腸組織損傷[21-22]。以上結(jié)果為探究NOS2在團(tuán)頭魴個(gè)體免疫反應(yīng)中的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

    NOS2可以催化產(chǎn)生大量的NO,NO具有殺菌、抗腫瘤等防御作用,過(guò)量表達(dá)NO則加劇炎癥反應(yīng),造成機(jī)體組織損傷,因此研究NOS2在先天性免疫反應(yīng)中的作用則顯得極其重要。本實(shí)驗(yàn)室前期工作已經(jīng)證實(shí)團(tuán)頭魴TLR2參與抗嗜水氣單胞菌的免疫反應(yīng)[23],Toll樣受體識(shí)別微生物的組分后被激活,活化NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,隨后轉(zhuǎn)錄因子激活NOS2的啟動(dòng)子,誘導(dǎo)NOS2表達(dá)[24-25]。對(duì)于團(tuán)頭魴,NOS2的表達(dá)同TLR2-NF-κB是否存在聯(lián)系尚不清楚,其分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。目前對(duì)NOS2基因的研究多是在離體細(xì)胞水平[9,26],而對(duì)個(gè)體水平中NOS2基因的表達(dá)調(diào)控及功能研究較少。本研究檢測(cè)了嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴后其不同組織NOS2基因的表達(dá)水平及變化趨勢(shì),為研究NOS2在團(tuán)頭魴抵御嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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