頂空-氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定7種甲磺酸酯類雜質(zhì)

王少敏， 牛 穎， 代 敏， 魏 一， 劉宏民

(1.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2. 新藥創(chuàng)制與藥物安全性評價河南省協(xié)同創(chuàng)新中心 河南 鄭州 450001)

0 引言

基因毒性物質(zhì)是一類能對DNA結(jié)構(gòu)造成破壞而產(chǎn)生致癌性的物質(zhì)，因此對藥物中此類物質(zhì)的檢測引起人們廣泛關(guān)注[1-3].在制藥過程中，烷基磺酸常用作原料藥的成鹽試劑來提高藥物的穩(wěn)定性和溶解性，磺酸酯的前體物質(zhì)(如磺酰氯)也常用作反應(yīng)試劑或催化劑，這些應(yīng)用都可能生成磺酸酯類基因毒性物質(zhì)[4].替比培南酯是第1個可口服的碳青霉烯類抗生素，對大多數(shù)臨床分離的菌株均具有比青霉素及頭孢類抗生素更強的抗菌性，但由于在其側(cè)鏈的生產(chǎn)中使用了甲磺酰氯[5]，會與殘留的溶劑醇生成甲磺酸酯，因此需要對替比培南酯側(cè)鏈中的甲磺酸酯類雜質(zhì)進(jìn)行檢測.

目前檢測甲磺酸酯的方法主要有GC-MS法[6-10]、LC-MS法[11-13]和氣相色譜-微池電子捕獲法[14].微池電子捕獲檢測器靈敏度高，但線性范圍窄；質(zhì)譜(MS)檢測器因具有選擇性強、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)勢而成為重要的檢測手段[15].由于直接進(jìn)樣測定難以避免原料藥本身對儀器的污染及離子化效率低等問題，在GC-MS方法中，使用低揮發(fā)性的衍生試劑，通過頂空萃取揮發(fā)性衍生產(chǎn)物可有效降低基質(zhì)干擾.目前采用較多的方法是以乙腈/水(體積比80∶20)混合溶劑為衍生基質(zhì)的碘化鈉衍生方法[9-10]，本文改進(jìn)了碘化鈉衍生方法，將甲磺酸酯與碘化鈉在2-己酮/水(體積比3∶97)溶劑中反應(yīng)得到相應(yīng)的碘代烷烴產(chǎn)物，在優(yōu)化樣品的頂空萃取條件和色譜條件的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了同時對7種甲磺酸酯類雜質(zhì)的定性、定量檢測，可用于活性物質(zhì)中甲磺酸酯類雜質(zhì)的檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Trace ISQTM氣質(zhì)聯(lián)用儀，配套有Triplus頂空自動進(jìn)樣器、頂空進(jìn)樣瓶(20 mL)和Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(EI離子源，美國Thermo Scientific公司)；FiveEasy PlusTM pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司).

甲磺酸甲酯(MMS，98.0%，吳?；瘜W(xué)有限公司)；甲磺酸正丙酯(n-PMS)和甲磺酸異丁酯(i-BMS)(>98.0%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；甲磺酸仲丁酯(s-BMS)和甲磺酸正丁酯(n-BMS)(>98.0%，蘇州麥凱生物醫(yī)藥科技有限公司)；甲磺酸乙酯(EMS，98.5%)、甲磺酸異丙酯(i-PMS，97.0%)、碘化鈉(99.0%)、2-己酮(99.0%)(百靈威科技有限公司)；內(nèi)標(biāo)CHCl3(99.8%，J. T. Baker公司)；硫代硫酸鈉(99.0%，Sigma Aldrich公司)；其他試劑均為色譜純或分析純.

1.2 溶液的配制

衍生試劑：稱取60 g 碘化鈉和30 mg硫代硫酸鈉，加水溶解并稀釋至50 mL，搖勻備用.

內(nèi)標(biāo)溶液：量取CHCl3適量，用2-己酮溶解并稀釋，配制質(zhì)量濃度為14.84 g/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，再用超純水稀釋至質(zhì)量濃度為7.42 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻備用.

甲磺酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密量取MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS標(biāo)準(zhǔn)品適量，用2-己酮溶解并稀釋，配制質(zhì)量濃度約為5 g/L的儲備液，搖勻，于4 ℃冷藏備用.精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，用超純水分別稀釋至質(zhì)量濃度約為1、1、3、2、2、2、2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)制現(xiàn)用.

1.3 衍生反應(yīng)

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生：精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL置于20 mL頂空瓶中，加入超純水320 μL、2-己酮30 μL、內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和衍生試劑400 μL，立即加蓋密封，渦旋混勻，于60 ℃下反應(yīng)20 min.

樣品溶液的衍生：精密稱取原料藥25 mg置于20 mL頂空瓶中，加入超純水520 μL和2-己酮30 μL，渦旋使其溶解，再加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL和衍生試劑400 μL，立即加蓋密封，渦旋混勻，于60 ℃下反應(yīng)20 min.

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為TR-wax MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫：40 ℃保持6 min，然后以20 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣；流速為0.8 mL/min，恒流模式；進(jìn)樣口溫度200 ℃；進(jìn)樣量100 μL；進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比50∶1；孵化室溫度80 ℃，平衡時間為30 min.質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；EI離子源能量70 eV；檢測模式為選擇離子掃描(SIM).定量監(jiān)測離子：m/z142(碘甲烷)，m/z156(碘乙烷)，m/z170(碘代正丙/異丙烷)，m/z184(碘代正丁/異丁/仲丁烷)；m/z83(CHCl3).定性監(jiān)測離子：m/z127(碘代烷烴)，m/z118(CHCl3).

2 結(jié)果分析與討論

2.1 衍生反應(yīng)條件

2.1.1反應(yīng)溶劑和用量 目前的碘化鈉衍生方法均是以乙腈/水(體積比80∶20)混合溶劑為衍生基質(zhì)，衍生結(jié)束后經(jīng)頂空萃取，大量的強極性乙腈進(jìn)入儀器中會產(chǎn)生很強的溶劑峰，不僅降低離子源燈絲的壽命，還容易引起色譜柱的填料流失.因此，對一些出峰位置不干擾檢測物目標(biāo)組分的有機相進(jìn)行了考察.按1.3所述過程操作，其他條件不變，分別加入30 μL的有機相苯甲醚、氯苯、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸正丁酯、2-庚酮、正丁醇、2-己酮，與未加入有機相的各組分對比分析，發(fā)現(xiàn)2-己酮效果最好.同時對2-己酮的用量也進(jìn)行了優(yōu)化，確定2-己酮/水(體積比3∶97)的最佳用量為30 μL.

2.1.2衍生試劑用量 分別加入0.2、0.3、0.4、0.5 mL衍生試劑，按1.3所述過程操作，通過調(diào)整超純水用量使頂空瓶內(nèi)的液體總量保持在1 mL.結(jié)果表明，當(dāng)衍生試劑加入0.4 mL時可達(dá)到最佳衍生效果，略低于文獻(xiàn)[9-10]中0.5 mL的用量.

2.1.3衍生溫度和時間 按1.3所述過程操作，分別在40、50、60、70 ℃下衍生反應(yīng)20 min后進(jìn)樣測定，發(fā)現(xiàn)60 ℃下衍生效果最佳.在此基礎(chǔ)上，考察了反應(yīng)時間10、20、30、40 min對衍生反應(yīng)的影響，確定最佳反應(yīng)時間為20 min.

2.2 頂空萃取條件

將衍生后的樣品分別在50、60、70、80 ℃下平衡30 min后頂空進(jìn)樣分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，所檢測到的組分含量逐漸增大，其中相對分子質(zhì)量高的化合物受溫度的影響程度較大，考慮到頂空瓶內(nèi)壓力和氣密性等問題，選擇在80 ℃下平衡.在此基礎(chǔ)上，考察了在80 ℃下平衡時間對分析結(jié)果的影響，結(jié)果表明，平衡30 min時萃取效果最好，因此將頂空萃取條件設(shè)為80 ℃下平衡30 min.

2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

將新制的甲磺酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于室溫下放置，依次取放置0、20、40、60、80 min的樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在20 min內(nèi)各個組分可保持穩(wěn)定，超出20 min后，s-BMS最容易分解，其次是i-PMS和i-BMS.對衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，4個由混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的樣品衍生后于室溫下放置，每隔24 h檢測1個樣品，發(fā)現(xiàn)碘代烷烴產(chǎn)物在3 d內(nèi)都能保持穩(wěn)定.

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1線性范圍、精密度和回收率 將甲磺酸酯類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至7個質(zhì)量濃度，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比對樣品質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù).通過混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，由信號響應(yīng)信噪比(S/N)來確定檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，結(jié)果如表1所示.分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，檢出限為0.21～2.64 μg/L，定量限為0.70～8.81 μg/L，對應(yīng)的實際樣品的檢出限為8.4～106 ng/g，定量限為28～352 ng/g.取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS的質(zhì)量濃度分別為10、9、27、18、22、22、18 μg/L)進(jìn)行日內(nèi)、日間平行分析，經(jīng)過精密度計算，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)為0.95%～10.3%，滿足方法學(xué)的要求.稱取替比培南酯中間體樣品25 mg(含微量MMS、EMS和n-PMS雜質(zhì))，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS的質(zhì)量濃度分別為10、9、27、18、22、22、18 μg/L)進(jìn)行回收率試驗，各目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為88.2%～115.1%(n=3)，滿足方法學(xué)的要求.

表1 甲磺酸酯類化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、精密度和回收率Tab.1 The linear range, regression equation, correlation coefficient, precision and recovery of methanesulfonate compounds

2.4.2低級醇的干擾性實驗 文獻(xiàn)[9-10]中提出，空氣中的甲醇會與碘化鈉衍生試劑發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成碘甲烷，進(jìn)而對檢測準(zhǔn)確性造成一定的影響.而在本方法中，未見空白樣品中有甲醇帶來的干擾.作為補充，按照混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法配制了甲醇和乙醇的混合溶液，于頂空瓶中的質(zhì)量濃度均為127 μg/L，按同樣的方法進(jìn)行衍生分析，也未觀察到碘甲烷或碘乙烷譜峰的出現(xiàn)，表明空氣或樣品中殘留的甲醇或乙醇對該方法的檢測結(jié)果沒有影響.文獻(xiàn)[9-10]中的干擾可能是由于使用了大量有機相溶劑乙腈，促進(jìn)了干擾產(chǎn)物的生成.

2.4.3樣品分析 按上述方法對某藥企生產(chǎn)的5批替比培南酯中間體進(jìn)行分析，其SIM色譜圖如圖1所示.由圖1(a)可見，7 min內(nèi)所有目標(biāo)化合物均已出峰，內(nèi)標(biāo)CHCl3(IS)的保留時間為5.47 min，對應(yīng)MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS的衍生物的保留時間分別為2.25、2.77、3.06、4.05、 4.91、5.17、6.43 min.圖1(b)中保留時間為3.68、3.80 min的峰來源于溶劑本底.圖1(c)為實際樣品的SIM色譜圖(圖1(c)中的小圖分別為實際樣品中m/z142、m/z156和m/z170的萃取離子流圖)，均檢出MMS、EMS和n-PMS，來源于生產(chǎn)中甲醇、乙醇、丙醇等溶劑與甲磺酰氯的副反應(yīng)，而生產(chǎn)中未用到的異丙醇和正、異、叔丁醇沒有檢測到，5批樣品(S1～S5)的測定結(jié)果見表2.

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(a)、空白溶液(b)和實際樣品(c)的SIM色譜圖Fig.1 Selected-ion monitoring chromatograms of mixed standard solution (a), blank solution (b) and the sample (c)

樣品S1S2S3S4S5MMS0.1810.1990.1760.2130.188EMS0.2780.4380.4110.3740.414n-PMS0.0860.1430.0870.1400.153

3 結(jié)論

文獻(xiàn)[8，12]中報道的色譜-質(zhì)譜法對藥物中甲磺酸酯類雜質(zhì)同時檢測的數(shù)量最多有4種，本文方法可以同時對7種甲磺酸酯類雜質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，具有更廣泛的適用性.與基于碘化鈉衍生的GC-MS法相比，該方法避免了有機相乙腈的大量使用，僅使用少量2-己酮就可達(dá)到分析要求.由于衍生反應(yīng)溶劑中有機相用量少，避免了空氣或樣品中殘留的甲醇或乙醇對檢測結(jié)果的影響.該方法具有適用范圍廣、靈敏度高、基質(zhì)干擾小等特點，可用于藥物中間體、原料藥及成品藥中甲磺酸酯類雜質(zhì)的檢測.