五味子酸棗仁軟膠囊改善動(dòng)物睡眠功能的研究

白麗婷，王瑩，高卓林，趙麟萱，汪平，李萍，董藝霖，金向群，李海燕

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

睡眠是保障人們的正常生活和學(xué)習(xí)的重要活動(dòng)之一，良好的睡眠有助于消除疲勞，增強(qiáng)免疫力。然而，隨著社會(huì)的飛速發(fā)展，失眠已逐漸成為困擾人們工作生活的難題之一。近年來，改善睡眠的藥物層出不窮，但是其效果良莠不齊，給患者造成很多困擾。該試驗(yàn)中所用樣品是一種純中藥制劑，所用原料安全無毒，綠色環(huán)保，且廉價(jià)易得，具有一定程度的現(xiàn)實(shí)意義和良好的應(yīng)用前景。

五味子酸棗仁軟膠囊具有改善睡眠功能的作用。該軟膠囊配方是以中醫(yī)中藥理論為依據(jù)，根據(jù)中醫(yī)對(duì)失眠病因的分析以及中醫(yī)中標(biāo)本兼治思想進(jìn)行篩選，配方主要為五味子和酸棗仁。五味子是木蘭科植物五味子〔Schisandra chinensis (Turcz.) Baill〕的干燥成熟果實(shí)，藥用價(jià)值極高，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效。酸棗仁為鼠李科植物酸棗〔Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa (Bunge) Hu ex H.F.Chou〕的干燥成熟種子，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津之功效[1]。二者結(jié)合使用，可達(dá)到全方位補(bǔ)心氣、安心神的功效。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材 五味子酸棗仁軟膠囊，規(guī)格：0.5 g/粒，由長春中醫(yī)藥大學(xué)提供，吉林標(biāo)普生物工程有限公司生產(chǎn)，成人建議攝入量為0.033 3 g/（kg·d），每次4 粒，每天1 次；密封保存于陰涼干燥處。樣品配制：稱取該樣品膠囊內(nèi)容物10.0 g，加玉米胚芽油定容至200 mL為高劑量；稱量該樣品膠囊內(nèi)容物3.3 g，加玉米胚芽油定容至200 mL為中劑量；稱量該樣品內(nèi)容物1.7 g，加玉米胚芽油定容至200 mL 為低劑量。置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.1.2 試劑 戊巴比妥鈉（Sigma公司，批號(hào)：12k1005）；巴比妥鈉（天津市申泰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20130326）；玉米胚芽油（山東西王食品有限公司，批號(hào)20160128）。

1.1.3 主要儀器 DT100 型電子天平、FA2204B型電子天平、計(jì)時(shí)器（Sartorius 公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 KM 小鼠，SPF 級(jí)，雌性，體重18.0～22.0 g，48 只，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2011-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK-（吉）2015-0009。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證：SYXK-（吉）2015-0009，實(shí)驗(yàn)室溫度21～24℃；相對(duì)濕度39%～69%。

本試驗(yàn)分別以成人日建議攝入該受試樣品的5、10、30 倍設(shè)置劑量，低、中、高劑量組分別為 0.17、0.33、1.00 g/kg，玉米胚芽油作為陰性對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物每天給予受試樣品1 次，連續(xù)30 d，灌胃體積為20 mL/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物直接睡眠試驗(yàn) 將3 個(gè)劑量的受試樣品分別給予受試組動(dòng)物，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物睡眠現(xiàn)象。睡眠指標(biāo)為翻正反射消失。翻正反射：當(dāng)小鼠處于背臥位時(shí)，能立即翻正身位。翻正反射消失：超過30～60 s 不能翻正者，即認(rèn)為動(dòng)物進(jìn)入睡眠狀態(tài)，也就是翻正反射消失。翻正反射恢復(fù)即為動(dòng)物睡醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間。統(tǒng)計(jì)給予受試物后1h 內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

1.2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn) 各實(shí)驗(yàn)組每日1 次準(zhǔn)時(shí)攝入不同劑量受試樣品，灌胃體積為20 mL/kg，陰性對(duì)照組給予同體積玉米胚芽油，連續(xù)30d。在實(shí)驗(yàn)組小鼠末次攝入受試物30 min之后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)腹腔注射47.5 mg/kg 戊巴比妥鈉，注射量為0.01 mL/g，觀察小鼠狀態(tài)，以翻正反射消失為依據(jù)，觀察受試樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

1.2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠試驗(yàn) 各組動(dòng)物每天1 次按時(shí)給予不同劑量受試樣品，灌胃體積為20mL/kg，陰性對(duì)照組給予同體積玉米胚芽油，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)組小鼠末次攝入受試物30 min后，各實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)腹腔注射27.5mg/kg戊巴比妥鈉，注射量為0.01mL/g，在安靜且溫度為24～25 ℃的條件下，觀察實(shí)驗(yàn)組小鼠情況，以翻正反射消失達(dá)1 min以上為入睡動(dòng)物，記錄30 min內(nèi)每組入睡動(dòng)物數(shù)。

1.2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn) 各組動(dòng)物每天1 次按時(shí)灌胃不同劑量受試樣品，灌胃體積為20 mL/kg，陰性對(duì)照組給予同體積玉米胚芽油，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)組小鼠末次攝入受試物20 min 后，將體積為0.01mL/g的巴比妥鈉（250 mg/kg），以腹腔注射方式給予各實(shí)驗(yàn)組小鼠。以翻正反射消失為依據(jù)，觀察受試物能否延長巴比妥鈉睡眠潛伏期。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間延長試驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)中，一般采用方差分析。分析程序如下：先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算F 值，F(xiàn) 值＜F0.05，則各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值＞F0.05，P≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

在戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠試驗(yàn)和直接睡眠試驗(yàn)中，以入睡動(dòng)物數(shù)為計(jì)數(shù)資料，用X2檢驗(yàn)（確切概率法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小鼠體重的影響

由表1～3 可見，在延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠試驗(yàn)、巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)中，各組動(dòng)物每天1 次按時(shí)給予不同劑量受試樣品，連續(xù)30 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該樣品3 個(gè)劑量組在給予受試樣品期間，小鼠的體重增長與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），由此說明，五味子酸棗仁軟膠囊在這3 項(xiàng)試驗(yàn)中對(duì)小鼠增重?zé)o影響。

表1 對(duì)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn)小鼠體重的影響Table 1 Effect of prolonged pentobarbital sodium sleep time experiment on body weight of mice

表2 對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠試驗(yàn)小鼠體重的影響Table 2 Effect of pentobarbital sodium subthreshold dose sleep experiment on body weight of mice

表3 對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)小鼠體重的影響Table 3 Effect of barbital sodium sleep latency experiment on body weight of mice

2.2 對(duì)直接睡眠試驗(yàn)的影響

在直接睡眠試驗(yàn)中，高、中、低3 個(gè)劑量組的睡眠動(dòng)物和睡眠發(fā)生率皆為0，與陰性對(duì)照組的睡眠動(dòng)物只數(shù)和睡眠發(fā)生率相同，說明五味子酸棗仁軟膠囊對(duì)各劑量組小鼠直接睡眠無明顯影響。見表4。

表4 對(duì)直接睡眠試驗(yàn)的影響Table 4 Effect on direct sleep experiments

2.3 對(duì)延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

由表5可見，在延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的試驗(yàn)中，中、低劑量組小鼠睡眠時(shí)間與陰性對(duì)照組比較無差異（P＞0.05），而高劑量組小鼠睡眠時(shí)間與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此表明，五味子酸棗仁軟膠囊能延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時(shí)間，該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果呈陽性。

表5 對(duì)延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響Table 5 Effect of prolonging the sleep time of mice induced by pentobarbital sodium

2.4 對(duì)小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠的影響

在戊巴比妥鈉閾下計(jì)量睡眠試驗(yàn)中，高、中、低3個(gè)劑量組的睡眠發(fā)生率與陰性對(duì)照組比較差異不顯著（P＞0.05）。表明，五味子酸棗仁軟膠囊對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠睡眠發(fā)生率影響不明顯，該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。見表6。

表6 對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠睡眠發(fā)生率的影響Table 6 Effect of sleep on the incidence of sodium pentobarbital in subthreshold mice

2.5 對(duì)小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

在小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)中，低劑量組小鼠的睡眠潛伏期與陰性對(duì)照組比較無差異（P＞0.05），而高、中劑量組小鼠的睡眠潛伏期與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。表明，五味子酸棗仁軟膠囊能縮短小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期，試驗(yàn)結(jié)果呈陽性。見表7。

表7 對(duì)小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Table 7 Effect of mouse barbital sodium sleep latency

3 討論

本試驗(yàn)將五味子酸棗仁軟膠囊按照試驗(yàn)要求處理后，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物每天按相對(duì)應(yīng)的劑量給予受試樣品1 次，連續(xù)30 d，灌胃體積為20 mL/kg。共進(jìn)行4 項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，其中，延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間試驗(yàn)和巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗(yàn)的結(jié)果均呈陽性；戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗(yàn)的結(jié)果呈陰性，無直接催眠作用。按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中改善睡眠功能檢驗(yàn)方法，可判定五味子酸棗仁軟膠囊具有改善睡眠功能。