犬瘟熱病毒CDV-PS株致病力及基因進(jìn)化分析

施鵬飛，程悅寧，羅國良，王建科，程世鵬，易立

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

犬瘟熱是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，貂、狐、貉、犬、熊貓、虎等動物易感。在圈養(yǎng)的毛皮動物中，犬瘟熱病毒的致病性因宿主種類不同也有所差異，對水貂、狐貍和貉的致死率很高，其中貉子的致死率更高[1]，這種差異變化可能由于水貂、狐貍、貉種屬差異所致。犬瘟熱臨床癥狀以體溫呈現(xiàn)雙相熱、鼻炎、嚴(yán)重的消化道障礙和呼吸道炎癥等為特征，少數(shù)病例可發(fā)生腦炎。目前，對犬瘟熱CDV-PS 毒株非犬宿主的致病性研究較少，CDV-PS 株跨物種傳播原因還不清楚。因此，為了更好地研究犬瘟熱CDV-PS 毒株，本研究將CDV-PS毒株在實驗犬上進(jìn)行了模擬感染試驗，成功復(fù)制出了犬瘟熱癥狀。對感染試驗犬的臨床癥狀、臟器變化、組織病理變化以及病毒體內(nèi)分布和 H 基因特征進(jìn)行了詳細(xì)研究，為更好地預(yù)防和控制犬瘟熱病提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 CDV-PS 毒株（由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種動物病原與免疫團(tuán)隊保存）。

1.1.2 實驗動物 2月齡未經(jīng)免疫的幼年雄性犬（農(nóng)村土犬）5 只，體重分別為 4.7、5.3、4.9、5.8、5.5 kg。血清學(xué)檢測CDV 中和效價為陰性（SN≤4）。通過試紙條和采集糞便分泌物進(jìn)行PCR 確定實驗幼犬無細(xì)小病毒、腺病毒和冠狀病毒，排除了其他常見病原對本實驗的影響。

1.1.3 主要試劑 RNA 提取試劑TriZol（英杰公司）；Ex-Taq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、pMD18-T載體（大連寶生物公司）；無水乙醇、二甲苯、蘇木素和伊紅等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 病毒接種及觀察 實驗動物分為2 組，3 只犬為對照組（不攻毒），其余2 只為攻毒組，分別皮下接種CDV-PS 4mL。接種病毒前每日早、晚2 次測量體溫，并對動物進(jìn)行觀察。接種病毒后，每日測量體溫1 次，并對其臨床癥狀進(jìn)行觀察。

1.2.2 病理組織觀察 采取死亡犬的肝臟、脾臟、肺臟、膀胱和大腦等組織樣品，100mL/L中性福爾馬林溶液固定、流水沖洗、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，展片、附貼、烤片、染色。顯微鏡下觀察其病理組織變化。

1.2.3 H 基因克隆和序列 分別取病死犬臟器，依照文獻(xiàn)[2]方法對CDV H 基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109 感受態(tài)細(xì)胞，挑取目的單菌落并提取質(zhì)粒，測序，序列GenBank登陸號為：HM165273。序列數(shù)據(jù)的排列、轉(zhuǎn)換、分析比較均利用DNASTAR 軟件數(shù)據(jù)包進(jìn)行?；贜eighborjoining 法構(gòu)建種系發(fā)生樹，采用bootstrap=500 trails 驗證。進(jìn)化樹參考毒株的具體信息見表1。

表1 進(jìn)化樹參考毒株信息Table.1 Reference strain information of evolutionary tree

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和剖檢結(jié)果

接種CDV-PS的2 只試驗犬在接種病毒后出現(xiàn)明顯的食欲減退；隨后出現(xiàn)腳掌增厚；有大量眼瞼分泌物；有鼻液流出，開始是漿液性鼻液，后變成膿性鼻液。病初有干咳，后轉(zhuǎn)為濕咳，呼吸困難；發(fā)病后期身體發(fā)顫，表現(xiàn)為癲癇、轉(zhuǎn)圈、站立姿勢異常、步態(tài)不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)、咀嚼肌及四肢出現(xiàn)陣發(fā)性抽搐等其它神經(jīng)癥狀。臟器剖檢結(jié)果表明，肺部有大量的出血斑，肝腫大，腸系膜充血，膀胱壁變厚，腦膜充血、出血，腦腔積液等病變。

2.2 試驗犬體溫變化

攻毒組2 只試驗犬呈現(xiàn)典型的“雙相熱”。實驗犬1 體溫2 次增高到40 ℃以上，體溫第12 天后逐漸降低，死亡時已降到37 ℃以下，病程19 d；實驗犬2 接毒后體溫一直保持39 ℃以上，第18 天開始降低，后自愈，體溫恢復(fù)正常。對照組3 只體溫?zé)o明顯變化。見圖1。

2.3 組織病理學(xué)變化

病犬的病變主要發(fā)生在呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，肺部廣泛充血，肺泡腔內(nèi)充滿大量炎細(xì)胞，以中性粒為主（圖2-A），肺泡與肺泡之間間隔增寬，增寬的組織主要由單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞構(gòu)成，局部肺泡呈代償性擴(kuò)張，造成肺氣腫（圖2-B）；腦膜和腦實質(zhì)充血、水腫，神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性（圖2-C），可見吞噬細(xì)胞吞噬壞死的神經(jīng)纖維（圖2-D）；膀胱毛細(xì)血管輕度擴(kuò)張充血（圖2-E）；心肌細(xì)胞脂肪變性（圖2-F）；脾臟大量淋巴細(xì)胞浸潤（圖2-G）；肝臟偶見有壞死點（圖2-H）。

圖1 試驗犬接種犬瘟熱病毒后體溫變化情況Fig.1 Changes in body temperature of dogs after vaccination with canine distemper virus

圖2 犬主要病理組織學(xué)變化Fig.2 The main pathological changes of the dog

2.4 CDV-PSH基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

基于H 基因核苷酸序列，可將犬瘟熱病毒根據(jù)地域分類，CDV-PS毒株歸類于Asia-1 型，與我國目前主要的流行毒株一致。見圖3。

圖3 基于犬瘟熱病毒Ｈ基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic Tree Analysis of H Gene of Canine distemper virus

3 討論

本研究CDV-PS株在犬傳代，出現(xiàn)典型的雙相熱、肺炎、眼瞼分泌物等特征。犬瘟熱臨床癥狀呈多樣性，有肺炎癥狀、腸炎癥狀和腦炎癥狀[3]。在本次試驗中，接種病毒后動物同時出現(xiàn)了上述3 種癥狀，其中神經(jīng)癥狀是在病程后期出現(xiàn)，并導(dǎo)致犬不可逆轉(zhuǎn)的損害。在病理觀察中，肺部出現(xiàn)明顯的炎性損傷，出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞和炎性滲出物，造成肺氣腫；腦部神經(jīng)細(xì)胞腫脹變性，出現(xiàn)噬神經(jīng)現(xiàn)象等[4]，這與廣泛報道的犬瘟熱病毒主要損傷呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)論一致[5]。

基于犬瘟熱病毒H基因的遺傳進(jìn)化分析，可將其區(qū)分為亞洲Ⅰ型（Asia-Ⅰ）、亞洲Ⅱ型（Asia-Ⅱ）、歐洲型（Europe）、歐洲野生動物型（Europe wildlife）、美國型（America-2）、北極型（Arctic）和疫苗型（Vaccine或American-1）7 個基因型[6-9]以及新發(fā)現(xiàn)的非洲型-Africa[10]。本研究所分離的CDV -PS 歸屬于亞洲Ⅰ型（Asia-Ⅰ），與目前我國主要流行的犬瘟熱基因型一致。犬瘟熱病毒在試驗犬中的模擬感染研究為下一步開發(fā)犬瘟熱疫苗和犬瘟熱病相關(guān)治療制劑提供感染模型，對更好地控制和預(yù)防犬瘟熱有著非常積極的作用。