山東茶葉輕穩(wěn)定同位素和礦物元素特征與產(chǎn)地識(shí)別化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

聶 晶 張永志 趙 明 邵圣枝 劉 志 王 鈁 袁玉偉,* Karyne M.Rogers

(1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；3 青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 青島 266100；4 新西蘭GNS國(guó)家同位素中心，惠靈頓 下哈特 5040，新西蘭)

茶葉起源于中國(guó)，已成為當(dāng)今世界最為暢銷的飲品之一，深受人們的喜愛(ài)。作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物，茶葉種植范圍廣泛，種類眾多，文化底蘊(yùn)深厚，地域特色和品質(zhì)特征明顯，是典型的地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)50多個(gè)產(chǎn)地的茶葉品種已獲批地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，如龍井茶、普洱茶和信陽(yáng)毛尖茶等。這些地理標(biāo)志產(chǎn)品主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)，江北地區(qū)則主要集中在山東青島、日照、臨沂和泰安等地，尤以嶗山綠茶和日照綠茶最受歡迎[3]。這兩地茶葉自上個(gè)世紀(jì)60年代“南茶北引”以來(lái)，經(jīng)長(zhǎng)期在沿海地帶栽種培養(yǎng)，形成了外形粗壯、肥大，具有滋味濃厚、耐沖泡等地方特色[4-6]。

茶樹(shù)是一種喜暖、喜濕、喜酸的植物[7]，受光照、氣候、降雨和地理位置等因素影響，因此不同環(huán)境中，茶樹(shù)中的有機(jī)組分、特征官能團(tuán)、礦物元素含量或同位素比和穩(wěn)定同位素比值表現(xiàn)出一定的地域特征。近年來(lái)，研究人員利用不同分析技術(shù)對(duì)茶葉中各種組分進(jìn)行測(cè)試建立指紋圖譜，并開(kāi)展不同產(chǎn)地識(shí)別的化學(xué)計(jì)量學(xué)分析研究。利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)[8-9]、毛細(xì)管電泳[10-11](capillary electrophoresis, CE)對(duì)茶多酚類化合物和咖啡因進(jìn)行了定量分析，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatograph mass spectrometer, GC-MS)[12-13]對(duì)茶葉中的香氣成分進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，上述方法結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)建立產(chǎn)地模型，利用傅里葉紅外光譜技術(shù)對(duì)茶葉中特征官能團(tuán)進(jìn)行掃描分析，分別用偏最小二乘(partial least squares, PLS)[14]和PCA[15]對(duì)不同產(chǎn)地茶葉開(kāi)展產(chǎn)地溯源研究。元素分析-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜(elemental analyzer-stable isotope ratio mass spectrometry, EA-IRMS)和電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)等檢測(cè)技術(shù)以地球化學(xué)手段在茶葉溯源研究中已有研究實(shí)例，且2種方法與地理因素密切相關(guān)，不易受加工方式、氣候條件等因素的影響[16]。國(guó)外已在亞洲、非洲開(kāi)展了與產(chǎn)地相關(guān)的穩(wěn)定同位素和礦物元素的茶葉品種(紅茶、綠茶、花茶及烏龍茶)的研究，并取得了較好的應(yīng)用成果[17-18]。穩(wěn)定同位素比值(δ值)能反映生物生長(zhǎng)環(huán)境信息及其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)特性，其中，δ15N能夠揭示植物體施有機(jī)肥或化肥的情況[19-20]；礦物元素多與生物體所生長(zhǎng)的環(huán)境地質(zhì)息息相關(guān)[21]，栽培方式也會(huì)影響礦物元素含量的變化。將上述2種檢測(cè)手段共同用于茶葉產(chǎn)地溯源，可有效提高判別結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。目前，文獻(xiàn)報(bào)道主要針對(duì)國(guó)家、省份等地理尺度較大的產(chǎn)品識(shí)別[22-24]，且化學(xué)計(jì)量學(xué)方法均應(yīng)用于大尺度地理范圍的產(chǎn)品判別分析，而小尺度地理范圍(省內(nèi))的判別方法有待考證。

為研究山東不同產(chǎn)區(qū)茶葉的輕穩(wěn)定同位素和礦物元素特征，采用EA-IRMS和ICP-MS測(cè)定了山東各茶葉產(chǎn)地(青島嶗山和膠南、日照、臨沂-泰安等地區(qū))的茶葉樣品，分析相關(guān)同位素和礦物元素的測(cè)定值與產(chǎn)地特征影響因素，以期為地理尺度更小的茶葉產(chǎn)地判別和地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2013-2015年茶葉樣品由青島(嶗山和膠南)、日照、臨沂-泰安等地的茶葉企業(yè)提供，總樣品量為137份。各產(chǎn)地地理位置見(jiàn)圖1，各年份、產(chǎn)地樣品信息如表1所示。

圖1 青島(嶗山、膠南)、日照、泰安-臨沂地理位置圖Fig.1 Geographical map of Qingdao(Laoshan, Jiaonan), Rizhao, and Taian & Linyi

表1 茶葉樣品數(shù)量及原產(chǎn)地Table 1 The amount of tea samples and their origin

硝酸和過(guò)氧化氫，分析純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA-CH-6(蔗糖，δ13CV-PDB=-10.449‰±0.033‰)、IAEA-600(咖啡因，δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰，δ15Nair=-1.0‰±0.2‰)、IAEA-N-2(硫酸銨，δ15Nair=20.3‰±0.2‰)、IAEA-601(苯甲酸，δ18OV-SMOW=23.14‰±0.19‰)、IAEA-602(苯甲酸，δ18OV-SMOW=73.35‰±0.39‰)、IAEA-CH-7(聚乙烯，δ2HV-SMOW=-100.3‰±2.0‰)，均購(gòu)自國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA，奧地利)；B2203(δ2HV-SMOW=-25.3‰±1.1‰)購(gòu)自Elemental Microanalysis公司(英國(guó))。礦物元素測(cè)定所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心(北京，中國(guó))。

1.2 主要儀器與設(shè)備

XP6型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；Vario PYRO cube型元素分析儀，德國(guó)Elementar公司；Isoprime100型穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，英國(guó)Isoprime公司；Mars 5型微波消解儀，美國(guó)CEM公司；X-series Ⅱ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司;HR2864粉碎機(jī)，中國(guó)飛利浦。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 茶葉樣品用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎處理，并將粉碎完成的樣品過(guò)60 目篩，避光常溫保存，待測(cè)。

1.3.2 穩(wěn)定同位素比值測(cè)定

1)C和N同位素：稱取茶葉樣品2.0～4.0 mg，放入錫箔舟中包樣；按編號(hào)將包樣放入元素分析儀的固體樣品自動(dòng)進(jìn)樣盤。樣品中碳、氮元素在經(jīng)燃燒還原后分別轉(zhuǎn)化為CO2和N2，進(jìn)入穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。儀器具體參數(shù)：元素分析儀燃燒爐和氧化爐的溫度分別為920和600℃，載氣氦氣，流量為250 mL·min-1。

2)H和O同位素：稱取茶葉樣品0.4～0.6 mg，放入銀舟中包樣；按編號(hào)放入元素分析儀自動(dòng)固體樣品進(jìn)樣盤中。樣品中的氫、氧元素在經(jīng)高溫裂解分別轉(zhuǎn)化為H2和CO，進(jìn)入穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。儀器具體參數(shù)：元素分析儀裂解爐溫度為 1 450℃，氦氣流量為150 mL·min-1。

3)穩(wěn)定性同位素比率值：參照下列公式計(jì)算：

(1)

式中，R樣品為所測(cè)樣品中重同位素與輕同位素豐度之比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素豐度比。

測(cè)試數(shù)據(jù)均采用兩點(diǎn)校正法進(jìn)行處理定值，即δ13CV-PDB采用IAEA-CH-6、IAEA-600標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正，δ15Nair采用IAEA-N-2、IAEA-600標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正，δ18OV-SMOW采用IAEA-601、IAEA-602標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正，δ2HV-SMOW采用B2203、IAEA-CH-7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正。

1.3.3 礦物元素含量及鉛同位素比測(cè)定 稱取0.5 g的茶葉樣品于微波消解罐中，加入4.0 mL 2.0 mol·L-1硝酸和2.0 mL 30%過(guò)氧化氫，室溫下預(yù)消解20 min后，擰上蓋子，放入微波消解儀消解。消解完成后，冷卻至室溫取出內(nèi)罐，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶并用超純水定容，待測(cè)。同位素比測(cè)定選取同位素比率測(cè)定模式，礦物元素含量測(cè)定時(shí)用銠和錸作為內(nèi)標(biāo)溶液(1.00 ng·mL-1)，監(jiān)控和校正儀器漂移。

1.4 數(shù)據(jù)處理及模型建立

首先采用SPSS 18.0(美國(guó)IBM公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVA)，使用兩兩類別比較方法對(duì)各檢測(cè)元素進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。然后利用SIMCA-p13.0(Umetrics，德國(guó)Sartorius公司)進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東不同產(chǎn)地茶葉輕同位素比率特征

根據(jù)地理位置分布，嶗山、膠南和日照均為沿海地區(qū)，泰安-臨沂為沿海內(nèi)陸地區(qū)，各地茶葉中輕同位素比率結(jié)果如表2所示。除膠南與嶗山茶葉中的δ15N值具有顯著差異外，其他地區(qū)的穩(wěn)定同位素比值不存在顯著性差異，而δ13C、δ2H和δ18O值范圍變化較小，無(wú)顯著差異。δ15N值的變化范圍較小(2.5‰～4.0‰)，且膠南產(chǎn)地值最小，這可能與茶葉施氮肥方式和種類相關(guān)；δ13C值變化為-25.7‰～-24.9‰，各地差異不顯著；δ2H和δ18O總體數(shù)值變化不大，變化范圍分別為-66.2‰ ～ -60.4‰和24.7‰～27.3‰，δ2H和δ18O值依此遞減的次序?yàn)槟z南>嶗山>日照>泰安-臨沂產(chǎn)地。結(jié)合地理位置可得出，從沿海地區(qū)到內(nèi)陸地區(qū)2種穩(wěn)定同位素比值逐漸下降，該趨勢(shì)與降水穩(wěn)定同位素相同，即降水穩(wěn)定同位素會(huì)隨著遠(yuǎn)離海岸線而逐漸貧化，形成“大陸效應(yīng)”，此類效應(yīng)對(duì)大陸的沿海地區(qū)更為顯著[25]。此外，對(duì)以上產(chǎn)地茶葉δ2H 和δ18O相關(guān)線性分析(圖2)，各地的相關(guān)性良好，其中沿海地區(qū)的相關(guān)性高于沿海內(nèi)陸地區(qū)。如膠南茶葉中氫氧同位素R2達(dá)到0.817 5，嶗山茶葉中氫氧同位素R2為0.696 1，日照茶葉氫氧同位素R2為0.595 6，而內(nèi)陸地區(qū)(臨沂-泰安)R2僅為0.401 7；同時(shí)，各地氫、氧相關(guān)性的排序與同位素平均值的排序相同，即沿海地區(qū)高于沿海內(nèi)陸地區(qū)。由此可見(jiàn)，降水對(duì)該類地區(qū)茶葉葉片同位素比值的影響具有重要意義。

表2 山東不同地區(qū)茶葉樣品同位素δ值平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Mean values and standard deviations of isotope ratios oftea samples fromdifferent regions in Shandong

注：不同小寫字母表示經(jīng)單因素方差分析，樣本間存在顯著差異(P<0.05)。下同。
Note: Different lowercases represent that significance exists between inter-samples after one-way ANOVA(P< 0.05). The same as following.

注：A：嶗山； B： 膠南； C：日照； D：臨沂-泰安地區(qū)。Note: A: Laoshan. B: Jiaonan. C: Rizhao. D: Linyi & Taian region.圖2 各地茶葉中δ2H 和δ18O相關(guān)線性分析圖Fig.2 The relevance analysis of δ2H and δ18O of tea samples

2.2 山東不同產(chǎn)地茶葉礦物元素特征

茶葉中礦物元素受種植環(huán)境和施肥的影響，呈現(xiàn)一定的地域特性。針對(duì)山東產(chǎn)地茶葉中22種礦物元素特征進(jìn)行測(cè)定并結(jié)合單因素方差分析，結(jié)果如表3所示。

根據(jù)元素含量，可大致分為痕量(<1 mg·kg-1)、微量(1～100 mg·kg-1)和常量(>100 mg·kg-1)元素3類，其中，痕量礦物元素有7種(Be、Cd、Cs、Ⅴ、Li、Co、Mo)，微量礦物元素有7種(Ga、Cr、Ni、Cu、Ba、Rb、Zn)，常量礦物元素有6種(Al、Fe、Ca、Mg、Mn、K)。此外，2個(gè)Pb同位素比(206Pb/207Pb、208Pb/206Pb)在各地的均值為1.1 ～2.1，鉛(Pb)同位素作為重要的地質(zhì)示蹤指標(biāo)，其在農(nóng)產(chǎn)品中表現(xiàn)特征與地質(zhì)環(huán)境密切相關(guān)[26-27]。痕量礦物元素中，嶗山茶葉中Be和Cd元素顯著高于日照，Cd雖是有毒元素，但其含量低于國(guó)家規(guī)定茶葉中的限值(1 mg·kg-1)[28]，對(duì)人體健康的影響可忽略；膠南茶葉中的Li元素含量與其他產(chǎn)地呈現(xiàn)顯著差異。微量礦物元素中，各地差異情況不同；Cr元素含量在日照與臨沂-泰安地區(qū)出現(xiàn)顯著差異，Ni元素含量則表現(xiàn)在日照、臨沂-泰安地區(qū)與嶗山茶葉不同，Cu元素含量在青島地區(qū)顯著高于日照地區(qū)，且其在日照、臨沂-泰安地區(qū)的偏差較大；Ba元素含量在臨沂-泰安地區(qū)顯著高于其他3個(gè)地區(qū)；Zn元素含量在日照和膠南地區(qū)表現(xiàn)出差異性。常量礦物元素中，嶗山茶葉中的Fe和K元素含量顯著高于臨沂-泰安地區(qū)，Ca元素含量顯著高于日照地區(qū)，而Mg元素含量顯著低于膠南地區(qū)。206Pb/207Pb和208Pb/206Pb表現(xiàn)為臨沂-泰安地區(qū)顯著高于其他3個(gè)地區(qū)。綜上所述，嶗山產(chǎn)區(qū)茶葉中的某幾種元素與其他一兩個(gè)產(chǎn)地具有顯著差異，但未有一個(gè)元素含量與其他3個(gè)產(chǎn)地茶葉都具有差異性；臨沂-泰安地區(qū)處于沿海內(nèi)陸，該產(chǎn)地與其他產(chǎn)地具有較大差異性,呈現(xiàn)空間分布上的差異特征。

2.3 山東不同產(chǎn)地茶葉產(chǎn)地計(jì)量學(xué)判別分析

PLS-DA是基于PLS回歸的一種判別方式，主要反映預(yù)測(cè)變量和因變量之間的線性關(guān)系，是一種有監(jiān)督的分類方法[29-30]。本研究采用4個(gè)同位素比值(δ值)與22個(gè)元素含量或元素同位素比率作為量測(cè)變量，對(duì)137份茶葉樣品進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)判別分析。為降低地理尺度相近對(duì)變量的影響，采用PLS-DA對(duì)日照、嶗山茶葉分別與其他地區(qū)茶葉進(jìn)行建模判別，以提高模型的分辨力。圖3能夠直觀反映出樣本間的相同與差異性，圖3-A、B中樣本基本都在95%Hotelling′s T2置信范圍內(nèi)，因此，模型建立的可信度較高。圖3-C、D分別表示嶗山和日照茶葉判別模型中各變量對(duì)第1潛變量重要性(variable important for the projection, VIP)，可量化每個(gè)量測(cè)變量對(duì)判別的貢獻(xiàn)，VIP值越大(>1)，對(duì)產(chǎn)地判別的差異性越顯著[29]。在嶗山茶葉模型中共得出6個(gè)潛變量，擬合參數(shù)R2X為0.555，Q2為0.257；圖3-A中黑色圖標(biāo)代表嶗山地區(qū)的茶葉樣本，灰色圖標(biāo)代表日照、膠南和泰安-臨沂地區(qū)的茶葉樣本，嶗山茶葉基本能與山東其他產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分；圖3-C中有6個(gè)量測(cè)變量(206Pb/207Pb、Cd、Be、K、Co和Ni)的VIP值>1，說(shuō)明以上變量在嶗山茶葉與其他產(chǎn)地中的茶葉差異較為顯著。在日照茶葉模型中共得出3個(gè)潛在變量，擬合參數(shù)R2X為0.341，Q2為0.563；圖3-B中黑色圖標(biāo)代表日照地區(qū)的茶葉樣本，灰色圖標(biāo)代表嶗山、膠南和泰安-臨沂地區(qū)的茶葉樣本，可知日照茶葉與山東其他產(chǎn)地能有效區(qū)分；圖3-D中有8個(gè)量測(cè)變量(206Pb/207Pb、Cu、Ca、Ga、Cd、Zn、Ba和208Pb/206Pb)的VIP值>1，說(shuō)明以上變量在日照茶葉與其他產(chǎn)地中的茶葉差異達(dá)到了顯著水平。

表3 山東不同地區(qū)茶葉樣品礦物元素含量或同位素比值Table 3 Content of mineral elements and stable isotope ratio in tea samples fromdifferent regions in Shandong

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
Note: The value in the table means average value ± standard deviation.

進(jìn)一步將訓(xùn)練集的137份樣品作為驗(yàn)證集樣品回驗(yàn)?zāi)Ｐ妥R(shí)別準(zhǔn)確度，結(jié)果如表4所示。嶗山茶葉模型中，嶗山茶葉準(zhǔn)確度為89.7%，其他產(chǎn)地茶葉的準(zhǔn)確度為100%，總體準(zhǔn)確度達(dá)97.8%；日照茶葉模型中，日照茶葉準(zhǔn)確度為92.6%，其他產(chǎn)地茶葉的準(zhǔn)確度為100%，總體準(zhǔn)確度達(dá)96.4%。2個(gè)模型中其他產(chǎn)地茶葉的準(zhǔn)確度為100%，表明模型的準(zhǔn)確度較高。

注：A和 B分別為嶗山與日照茶葉模型的三維空間投影坐標(biāo)圖；C和D分別為嶗山與日照茶葉模型的第1潛變量重要性因子圖。Note: A, B are for Laoshan and Rizhao tea model of projection, respectively. C and D are for Laoshan and Rizhao tea model of 1st VIP, repectively.圖3 嶗山與日照茶葉模型PLS-DA分析圖Fig.3 PLS-DA model analysis for Laoshan and Rizhao tea samples

表4 嶗山與日照茶葉PLS-DA模型判別分析結(jié)果Table 4 The OPLS-DA model statistical results for Laoshan and Rizhao tea samples

3 討論

茶樹(shù)屬于典型的C3植物，在光合作用過(guò)程中參與反應(yīng)的葉綠體只存在于葉肉細(xì)胞中，即光合作用的產(chǎn)物——碳水化合物(糖類)在葉片中生成并儲(chǔ)存，從而能進(jìn)一步被運(yùn)送到莖稈合成植物自身所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。碳水化合物中的碳、氧元素均來(lái)自二氧化碳，氫來(lái)自水。本研究結(jié)果表明，各地茶葉中δ13C值差異均未達(dá)到顯著水平，δ18O與δ2H值雖差異不顯著，但出現(xiàn)了一定的變化規(guī)律，即沿海地區(qū)高于沿海內(nèi)陸地區(qū)，且δ18O與δ2H值呈現(xiàn)一定的線性相關(guān)性。光合作用過(guò)程中，攝取的氫參與合成有機(jī)物會(huì)發(fā)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)使得δ2H發(fā)生明顯同位素分餾效應(yīng)[31]，但本研究中，從空間分布看，各地茶葉中δ2H與降水穩(wěn)定同位素(大陸效應(yīng))變化一致。此外，各地茶葉中δ18O值變化規(guī)律與降水穩(wěn)定同位素變化一致，這與光合作用對(duì)氧同位素分餾密切相關(guān)。CO2作為光合作用重要的反應(yīng)物質(zhì)，首先經(jīng)氣孔向葉內(nèi)擴(kuò)散，部分被固定的CO2在與水反應(yīng)生成葡萄糖的過(guò)程中，氧原子會(huì)在碳酸酐酶的催化下迅速與葉片水中的氧進(jìn)行同位素交換，發(fā)生δ18O分餾，從而獲得葉片水同位素信號(hào)。前人在研究大氣降水與植物葉片水中發(fā)現(xiàn)，δ18O與δ2H值有較好的線性關(guān)系[32-33]，本研究發(fā)現(xiàn)沿海地區(qū)茶葉中δ18O與δ2H值也呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，且隨著向內(nèi)陸地區(qū)的深入，兩者相關(guān)性下降。植物中的氮主要靠吸收土壤中的氮元素，在吸收、利用和同化NO3-和NH4+等無(wú)機(jī)鹽的過(guò)程中會(huì)發(fā)生不同程度的氮同位素分餾，同時(shí)δ15N值也與施肥種類有關(guān)(化肥或有機(jī)肥)。袁玉偉等[19, 34]指出有機(jī)-化肥配施比例會(huì)影響黃瓜與大白菜葉片中δ15N值，并且可以通過(guò)該值判定植物在生長(zhǎng)過(guò)程中是否使用化肥。日本研究學(xué)者[2]指出判定茶葉使用過(guò)化肥的δ15N閾值應(yīng)在5‰左右；馮海強(qiáng)等[35]認(rèn)為如果茶葉中δ15N值在7‰以下，則大多使用了化肥氮肥。本研究結(jié)果表明，嶗山茶葉中δ15N與其他地區(qū)的差異達(dá)到了顯著水平，因此使用化肥氮肥的可能性也較大。

植物中礦物元素主要從土壤礦物質(zhì)中獲得，土壤酸堿性會(huì)影響土壤中的化學(xué)反應(yīng)，如土壤pH值過(guò)低或過(guò)高，常會(huì)使土壤元素有效性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致不同產(chǎn)地的土壤中元素含量出現(xiàn)差異[7]。茶樹(shù)屬喜酸植物，酸性土壤是茶樹(shù)生長(zhǎng)所必需的生態(tài)條件之一。嶗山、膠南和日照茶葉種植地區(qū)依山傍海，地貌為低山丘陵區(qū)，氣候?qū)贉貛Ъ撅L(fēng)區(qū)，地質(zhì)特征主要以中酸性侵入體為基巖，巖石類型主要為花崗巖，種植土壤為棕壤土，土層較薄[4-5,21]，土壤pH值呈弱酸性，適合茶樹(shù)生長(zhǎng)。泰安-臨沂地區(qū)地處山東省中部，冬季低溫干燥、降水量較其他產(chǎn)地少，具有高山氣候的自然條件，是茶樹(shù)種植的次種植區(qū)[36]。因此,根據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，沿海三地的差別可能與土壤中有機(jī)質(zhì)差異、人類活動(dòng)相關(guān)。

通過(guò)穩(wěn)定同位素比值和各礦物元素含量或同位素比共計(jì)26個(gè)變量，分別對(duì)嶗山與日照茶葉PLS-DA建立模型，驗(yàn)證模型中總體準(zhǔn)確率為97.8%(嶗山模型)和96.4%(日照模型)。利用該方法和模型對(duì)嶗山綠茶和日照綠茶進(jìn)行有效鑒別，為保護(hù)地理尺度范圍較小的地理標(biāo)志產(chǎn)品和產(chǎn)地溯源提供了方法學(xué)參考。同時(shí)，該模型可引入更多變量，有助于提高模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，如氣象因子等[37]。

4 結(jié)論

為挖掘山東不同產(chǎn)地茶葉同位素比值和礦物元素含量特征，有效區(qū)分小尺度范圍產(chǎn)地的茶葉，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分別對(duì)日照綠茶和嶗山綠茶進(jìn)行建模分析。通過(guò)單因素方差分析，對(duì)山東多產(chǎn)地茶葉中δ13C、δ2H、δ18O 4種穩(wěn)定同位素比值以及δ15N和22種礦物元素含量或同位素比進(jìn)行特征機(jī)理探討。結(jié)果顯示，山東茶葉中δ13C值差異較小，δ2H、δ18O值表現(xiàn)出沿海地區(qū)高于沿海內(nèi)陸地區(qū)的規(guī)律，且δ18O與δ2H值呈線性相關(guān)性；嶗山產(chǎn)地的δ15N值較大，且與其他產(chǎn)地呈顯著差異。臨沂-泰安產(chǎn)地與嶗山、膠南和日照三地地質(zhì)條件不同，使得茶葉中某些礦物元素出現(xiàn)空間分布上的差異特征。采用PLS-DA模型有效鑒別了嶗山綠茶與日照綠茶山東地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，該法對(duì)地理尺度更小的產(chǎn)品識(shí)別提供了研究思路。