甘蔗抗褐銹病基因定位親本間多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選

單紅麗 李文鳳 黃應(yīng)昆 王曉燕 張榮躍 李 婕 尹 炯 倉曉燕

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠(yuǎn) 661699)

甘蔗褐銹病(Sugarcane brown rust)是由黑頂柄銹菌(PuccinamelanocephalaH. Sydow &P. Sydow)引起的一種流行性真菌病害，普遍存在于世界各國的甘蔗種植區(qū)[1-3]。據(jù)統(tǒng)計，甘蔗褐銹病可導(dǎo)致甘蔗減產(chǎn)10%～40%，蔗糖含量下降10%～36%[4]，導(dǎo)致一些豐產(chǎn)高糖品種如CP78-1247、CL41-23等被淘汰[5-6]，桂糖15號、桂糖17號、臺糖86-1626、Mex105、P44、粵糖60號、德蔗03-83等面臨淘汰[3,7]，以及福農(nóng)41、云蔗09-1601等優(yōu)良品種難以推廣[8]。甘蔗褐銹病已成為影響甘蔗產(chǎn)業(yè)的主要病害之一。1996年Daugrois等[9]首次在甘蔗品種R570上發(fā)現(xiàn)抗褐銹病主效基因Bru1，隨后國內(nèi)外研究者進行了大量研究證實Bru1是世界甘蔗遺傳基礎(chǔ)中褐銹病抗性的主要來源[10-12]。但由于甘蔗褐銹病病原菌會隨著寄主抗性基因的選擇而發(fā)生突變，難以徹底消滅褐銹病。因此，不斷發(fā)掘新的褐銹病抗性基因，選育持久抗性品種對延長品種抗性壽命、抑制甘蔗褐銹病流行具有重要意義。

近年來，DNA分子標(biāo)記技術(shù)的迅猛發(fā)展，極大地促進了甘蔗遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，進一步提高了甘蔗抗病基因定位的可靠性[13]。目前，限制性片段長度多態(tài)性(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)等分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于甘蔗的研究，其中SSR標(biāo)記因具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、穩(wěn)定性好、標(biāo)記均勻分布于全基因組等優(yōu)點，已成為甘蔗遺傳圖譜構(gòu)建和抗病基因定位中最主要的標(biāo)記之一[14]。如Piperidis等[15]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了Q117和MQ77-340的遺傳圖譜；劉新龍等[16]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了一個雜交和一個回交群體的遺傳圖譜；Andru等[17]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了美國路易斯安那州主栽品種LCP85-384的遺傳圖譜；Raboin等[18]利用SSR標(biāo)記構(gòu)建了R570和MQ76-53的遺傳圖譜，并在MQ76-53的遺傳圖譜上定位了1個控制紅色蔗莖的基因和1個抗褐銹病的新基因；楊翠鳳[19]利用SSR標(biāo)記分別構(gòu)建了母本GXS85-30和父本GXS87-16的分子遺傳圖譜，并在父母本遺傳圖譜上共檢測到控制黑穗病性狀的4個主效QTL和51個微效QTL。雖然甘蔗分子遺傳連鎖圖譜相繼被構(gòu)建，但由于甘蔗是異源多倍體, 基因組血緣組成高度復(fù)雜, 染色體數(shù)量龐大，所以這些圖譜的覆蓋范圍仍然較小, 且標(biāo)記間遺傳距離較大, 圖譜飽和度低，因此，需要篩選更多可用于構(gòu)建遺傳圖譜的分子標(biāo)記。

褐銹病抗性通常被認(rèn)為是一種具有較高遺傳力的數(shù)量遺傳性狀[20]。高密度的遺傳圖譜有助于基因定位、基于圖譜的基因克隆和精確分析數(shù)量性狀基因，而構(gòu)建高密度的遺傳圖譜需要大量多態(tài)性豐富的分子標(biāo)記[21]。本研究選擇6個高抗褐銹病不含Bru1基因的甘蔗品種(可能含有新的抗病基因)和6個高感褐銹病的甘蔗品種進行配置雜交組合，篩選在各雜交組合抗病和感病親本間條帶清晰、多態(tài)性明顯、重復(fù)性較好的SSR標(biāo)記，旨在提供更多遺傳連鎖圖譜構(gòu)建可用的多態(tài)性標(biāo)記，以期為開展甘蔗抗褐銹病基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從國家甘蔗種質(zhì)資源圃(云南開遠(yuǎn))中選擇6個高抗甘蔗褐銹病不含Bru1的品種(粵糖00-236、粵糖93-159、德蔗93-88、ROC24、滇蔗茅95-19、滇蔗茅95-20)和6個高感甘蔗褐銹病的品種(Mex105、ROC26、德蔗03-83、粵糖03-393、柳城03-1137、云蔗06-407)，根據(jù)感病母本×抗病父本原則選配12個雜交組合，12個組合詳見表1。

1.2 基因組DNA的提取和檢測

各材料分別采集充分展開的第1片新葉，按照植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)說明書提取葉片總DNA，利用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀(Eppendorf公司，德國)檢測DNA濃度及純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR引物篩選

通過查閱文獻(xiàn)及在甘蔗表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(Sugarcane Expressed Sequence Tag Database)上搜索引物序列信息，最終選取前人[22-27]研究報道在甘蔗上具有較好多態(tài)性的84對SSR引物，由上海生工生物公司合成。以12個雜交組合親本材料基因組DNA為模板，先對84對SSR引物進行初篩，選出在不同組合親本間具有差異的引物，然后再對初篩所得引物進行復(fù)篩，最后獲得各個組合親本間條帶清晰、多態(tài)性明顯、重復(fù)性較好的引物。

1.4 SSR-PCR擴增

PCR擴增體系為10 μL，包括2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE(北京全式金生物技術(shù)公司)4.5 μL，模板DNA(20 ng·μL-1)0.5 μL，上、下游引物(10.0 μmol·L-1)各0.5 μL，然后加無菌ddH2O補足至10 μL。SSR-PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性15 s, 54℃退火15 s,72℃ 延伸1 min, 35個循環(huán)；72℃終延伸5 min，4℃保存。

1.5 擴增產(chǎn)物的電泳分離

擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，采用銀染法進行染色，輕搖至DNA條帶顯示清晰，然后倒掉顯色液，用蒸餾水漂洗2遍，觀察記錄帶型并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測

對12份親本材料的DNA濃度和質(zhì)量進行檢測，所提取DNA的OD260/OD280均介于1.7～1.9 之間。由圖1可知，提取的DNA為一條清晰完整的帶，條帶大小一致，無蛋白質(zhì)和RNA污染。說明提取的DNA完整，純度高，符合要求。

2.2 抗性親本間SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

84對SSR引物在12個雜交組合親本間的多態(tài)性分析結(jié)果表明，父本相同的雜交組合親本間多態(tài)性引物數(shù)各不同，母本相同的雜交組合親本間多態(tài)性引物數(shù)也不同。柳城03-1137×德蔗93-88具有最多的多態(tài)性引物數(shù)，為44對，多態(tài)性比率也最高，為52.38%；Mex105×粵糖00-236的多態(tài)性引物數(shù)次之，為40對，多態(tài)性比率為47.62%；ROC26×粵糖93-159多態(tài)性引物數(shù)最少，為25對，多態(tài)性比率最低，為29.76% (表1)。

2.3 SSR 多態(tài)性標(biāo)記篩選

對各組合初篩所獲得的多態(tài)性引物進行復(fù)篩，由表2可知，不同親本組合獲得的多態(tài)性引物數(shù)介于6～11對，其中5-mSSCIR13、6-mSSCIR14等11對引物在德蔗03-83×滇蔗茅95-20中具有穩(wěn)定多態(tài)性；18-mSSCIR34、22-mSSCIR38等10對和6-mSSCIR14、14-mSSCIR27等10對引物分別在組合柳城03-1137×德蔗93-88和德蔗03-83×滇蔗茅95-19中具有穩(wěn)定多態(tài)性；13-mSSCIR26、19-mSSCIR35等9對引物在Mex105×ROC24中具有穩(wěn)定多態(tài)性；22-mSSCIR38、32-mSSCIR67等8對和6-mSSCIR14、40-mSSESTB06等8對和5-mSSCIR13、14-mSSCIR27等8對引物分別在組合云蔗06-407×粵糖93-159、粵糖03-393×滇蔗茅 95-19和粵糖03-393×滇蔗茅95-20中具有穩(wěn)定多態(tài)性；22-mSSCIR38、25-mSSCIR48等7對，18-mSSCIR34、22-mSSCIR38等7對，32-mSSCIR67、34-mSSESTA03等7對和20-mSSCIR36、27-mSSCIR53等7對引物分別在組合Mex105×粵糖00-236、德蔗03-83×粵糖93-159、粵糖03-393×ROC24和ROC26×德蔗93-88中具有穩(wěn)定多態(tài)性；32-mSSCIR67、52-mSSCIR51等6對引物在ROC26×粵糖93-159中具有穩(wěn)定多態(tài)性，表明這些引物可以用于后期遺傳圖譜的構(gòu)建。

注：1～6： 6個高感褐銹病親本材料；7～12∶6個高抗褐銹病親本材料。Note: 1-6: 6 highly susceptible parents to sugarcane brown rust. 7-12: 6 highly resistant parents to sugarcane brown rust.圖1 12份抗、感甘蔗褐銹病親本材料基因組DNA檢測結(jié)果Fig.1 Detection result of genomic DNA for 12 resistant and susceptible parents to sugarcane brown rust

表1 甘蔗抗銹病基因定位親本間SSR多態(tài)性分析Table 1 Polymorphic SSR markers analysis between resistant and susceptible parents for localization of brown rust resistance gene

由圖2和圖3可知，40號以后的引物多態(tài)性較好，其中2對引物75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*不僅在多態(tài)性最高的柳城03-1137×德蔗93-88中條帶清晰、差異大，而且在以德蔗03-83為母本的3個組合中多態(tài)性也較好，另外在ROC26×粵糖93-159中多態(tài)性也豐富，說明這2對引物穩(wěn)定性較高。

表2 親本間多態(tài)性較好SSR標(biāo)記信息Table 2 The information of good polymorphic SSR markers between resistant and susceptible parents

注：M：DNA marker (100 bp ladder)；46～84：在親本柳城03-1137×德蔗93-88間初篩出的多態(tài)性引物編號。箭頭所指為雙親差異明顯的帶。Note: M: DNA marker (100 bp ladder). 46-84: The polymorphic SSR primers number in Liucheng 03-1137 × Dezhe 93-88. The arrows point out different bands between parents.圖2 24對SSR引物在親本柳城03-1137×德蔗93-88間復(fù)篩的電泳圖Fig.2 The amplified results of 24 polymorphic SSR primers in Liucheng 03-1137×Dezhe 93-88

注：M： DNA marker (100 bp ladder)；39～78：在親本德蔗03-83×滇蔗茅95-19間初篩出的多態(tài)性引物編號。箭頭所指為雙親差異明顯的帶。Note: M: DNA marker (100 bp ladder). 39-78: The polymorphic SSR primers number in Dezhe 03-83 × Dianzhemao 95-19. The arrows point out different bands between parents.圖3 24對SSR引物在親本德蔗03-83×滇蔗茅95-19間復(fù)篩的電泳圖Fig.3 The amplified results of 24 polymorphic SSR primers in Dezhe 03-83× Dianzhemao 95-19

3 討論

甘蔗是高度異質(zhì)性的異源多倍體植物，其染色體數(shù)量較大(2n=100～130)，且遺傳距離也較大(18 000 cM)[28]，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，因此構(gòu)建飽和圖譜是有效定位主要基因的基礎(chǔ)。Asnaghi等[29]利用R570的精細(xì)遺傳圖譜定位了甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1。在構(gòu)建精密的遺傳圖譜前首先要確定親本組合，若親本材料選取不當(dāng)，會影響圖譜的構(gòu)建以及準(zhǔn)確性[30]。Racedo等[10]、李文鳳等[31]和Li等[12, 32]利用與Bru1緊密連鎖的R12H16和9020-F4標(biāo)記對甘蔗種質(zhì)、品種和育種材料進行褐銹病抗性的鑒定和評價，發(fā)現(xiàn)一些表型抗病但標(biāo)記檢測呈陰性的材料，暗示這些材料除了Bru1外還可能存在其他的抗褐銹病基因，可作為甘蔗褐銹病潛在替代抗性來源。本研究選擇了6個高抗褐銹病不含Bru1基因的甘蔗品種(可能含有新的抗病基因)為父本，與6個高感褐銹病的甘蔗品種配置12個雜交組合，利用84對SSR引物進行了抗病和感病親本之間的多態(tài)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)組合柳城03-1137×德蔗93-88和組合Mex105×粵糖00-236親本間多態(tài)性引物最多，分別為44對和40對，多態(tài)性比率最高，分別為52.38%和47.62%。表明以柳城03-1137×德蔗93-88、Mex105×粵糖00-236為親本材料構(gòu)建作圖群體，更有利于利用分子標(biāo)記對控制甘蔗褐銹病抗性數(shù)量性狀位點進行精細(xì)定位和目標(biāo)基因的圖位克隆。

研究表明，構(gòu)建遺傳圖譜的過程中，用于構(gòu)建圖譜的標(biāo)記越多，圖譜越密，準(zhǔn)確性越高，更有利于進行抗病基因精細(xì)定位和圖位克隆[33]。如Yang等[34]從 6 149 對SSR引物中篩選出了1 095對與高粱具有一致性的引物，進一步研究發(fā)現(xiàn)其中96對引物能用于甘蔗高密度遺傳圖譜構(gòu)建和黃銹病抗性數(shù)量性狀定位。楊翠鳳[19]從80對SSR引物中篩選出了50對多態(tài)性穩(wěn)定、條帶清晰的標(biāo)記用于割手密高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和黑穗病抗性QTL定位。本研究以篩選出擴增條帶清晰、多態(tài)性明顯、重復(fù)性好的引物為目標(biāo)，對各個組合初篩獲得的多態(tài)性SSR引物進行了復(fù)篩，在多態(tài)性最高的柳城03-1137×德蔗93-88中獲得了 18-mSSCIR34、22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、32-mSSCIR67、51-mSSCIR50、57-MSSCIR21、71-SMC1490CL*、73-SMC278CS*、75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*共10對具有穩(wěn)定多態(tài)性引物，在Mex105×粵糖00-236中獲得了22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、45-mSSESTC04、51-mSSCIR50、67-mSSCIR9*、76-SMC334BS*、80-SMC486CG*共7對具有穩(wěn)定多態(tài)性引物。因此，用篩選得到的10對多態(tài)性引物用于柳城03-1137×德蔗93-88為親本材料的作圖群體，7對多態(tài)性引物用于Mex105 ×粵糖00-236為親本材料的作圖群體，將更有利于構(gòu)建分子遺傳圖譜。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在6個高抗甘蔗褐銹病品種和6個高感甘蔗褐銹病品種為親本組成的12個雜交組合中，組合柳城03-1137×德蔗93-88多態(tài)性引物數(shù)最多，多態(tài)性比率最高；其次是組合Mex105×粵糖00-236。從84對SSR引物中篩選到10對(18-mSSCIR34、22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、32-mSSCIR67、51-mSSCIR50、57-MSSCIR21、71-SMC1490CL*、73-SMC278CS*、75-SMC31CUQ*、77-SMC336BS*)在組合柳城03-1137×德蔗93-88親本間多態(tài)性最好的引物，7對(22-mSSCIR38、25-mSSCIR48、45-mSSESTC04、51-mSSCIR50、67-mSSCIR9*、76-SMC334BS*、80-SMC486CG*)在Mex105×粵糖00-236親本間多態(tài)性最好的引物，下一步可分別用于2個組合的作圖群體。篩選出的親本間多態(tài)性SSR引物將有助于甘蔗抗褐銹病新基因分子標(biāo)記定位。本研究結(jié)果為后續(xù)抗褐銹病新基因定位和開發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記奠定了一定的理論基礎(chǔ)。