玉米TRV-VIGS的優(yōu)化與頂腐病抗病基因的鑒定

李聰聰 安曉暉 張中起 劉 康 孫 敬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095)

玉米(Zeamays)是重要的糧食作物和飼料作物，也是重要的模式植物[1-3]。玉米基因組序列測序的完成以及玉米嵌套關(guān)聯(lián)作圖群體的開發(fā)[4]，為玉米功能基因的研究和發(fā)掘利用奠定了基礎(chǔ)。

病毒介導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。VIGS技術(shù)通過沉默目標(biāo)基因，使植物產(chǎn)生沉默表型，從而判斷目標(biāo)基因的功能，無需遺傳轉(zhuǎn)化或創(chuàng)建突變體，具有快速、高效、高度特異性等優(yōu)點，適用于植物的高通量功能基因組學(xué)研究[5-6]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)30多種適用于雙子葉植物的VIGS載體，而適用于單子葉植物的VIGS載體較少[7-8]。其中成功應(yīng)用于玉米的VIGS載體僅有雀麥花葉病毒(Bromemosaicvirus，BMV)[9]、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)[10]、狐尾草花葉病毒(Foxtailmosaicvirus，F(xiàn)oMV)[11-12]和煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)[13]等。采用BMV、CMV和FoMV病毒沉默載體時，通常需要采用體外轉(zhuǎn)錄合成RNA直接接種玉米，或者先接種煙草或其他中介宿主植物，從中提取組裝好的病毒再接種玉米。一般需要采用摩擦接種法。但體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)量低、成本高、易降解，摩擦接種程度不容易掌握，摩擦過度易損傷葉片，摩擦不夠不易接種成功。有研究者采用摩擦接種法沉默八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)基因，發(fā)現(xiàn)其只能引起玉米葉片局部條紋化、白化[9-12]。Zhang等[13]利用TRV載體，通過真空輔助農(nóng)桿菌滲入及共培養(yǎng)的方法，無需RNA操作和接種，沉默PDS基因可使植株玉米整株白化，沉默效果更好、持續(xù)時間更長。然而，目前關(guān)于TRV-VIGS的沉默效率能否滿足大規(guī)模功能基因篩選的需求，影響玉米TRV-VIGS沉默效率的因素，以及如何優(yōu)化等方面的研究尚鮮見道。MAC(MOS4-associated complex)是以MAC3/PRP19為核心形成的一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，對植物免疫和抗病反應(yīng)起重要調(diào)控作用[14-16]，但在單子葉植物中的作用尚未見報道。

本研究利用TRV病毒載體，以玉米PDS基因為標(biāo)記基因，分別從農(nóng)桿菌菌株、玉米受體基因型、種子處理方法、真空滲入方法等因素進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，研究VIGS沉默MAC3的效率，接種亞粘團(tuán)鐮孢菌(Fusariumsubglutinans)，分析沉默MAC3對玉米頂腐病抗性的影響[17]，以期為TRV-VIGS體系應(yīng)用于玉米基因功能鑒定、玉米頂腐病抗病基因篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米品種鄭單958種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，從中擴(kuò)增PDS目的基因片段；先玉335種子由甘肅省張掖市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范基地提供，從中擴(kuò)增MAC3目的基因片段；pTRV1、pTRV2載體、大腸桿菌DH5α及農(nóng)桿菌GV3101、LB4404菌系均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室保存；限制性內(nèi)切酶、rTaq、反轉(zhuǎn)錄酶均購自上海皓嘉科技有限公司；InvitrogenTMTRIzolTM購自美國ThermoFisher公司；半胱氨酸(Cys)購自南京偉沃生物科技公司；卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮(actosyringone, AS)等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 玉米PDS和MAC3基因片段的克隆及VIGS載體構(gòu)建 按照Invitrogen Trizol 試劑盒說明書提取玉米葉片RNA，反轉(zhuǎn)合成cDNA第一鏈。根據(jù)NCBI中公布的玉米PDS基因序列(GRMZM2G410515)和MAC3基因序列(GRMZM2G037698)，參照文獻(xiàn)[18]選擇PDS的VIGS干擾靶標(biāo)片段，利用在線網(wǎng)站(http://vigs.solgenomics.net/，參數(shù)設(shè)置為n-mer size：21；Fragment length：500；mismatches：0；Database：ZeamaysB73 v5a)設(shè)計MAC3的VIGS干擾靶標(biāo)片段，分別在上下游引入XbaⅠ和BamHI酶切位點及保護(hù)堿基設(shè)計引物(ZmPDS-XbaI-F：5′-GCTCTAGACTAGCCAAGTTATTTCCTGA-3′，ZmPDS-BamHI-R：5′-CGGGATCCGGGACGGGAACTTCTCCTGA-3′；ZmMAC3-XbaI-F：5′-GCTCTAGAGCCGGTCAATACCAACAAGGTCGTGAA-3′，ZmMAC3-BamHI-R：5′-CGGGATCCCGCTTATGAAGGGGATGGCTGGAGATT-3′)。以玉米cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增ZmPDS和ZmMAC3基因片段。DNA凝膠回收試劑盒(南京諾百欣公司)回收純化PCR產(chǎn)物，將目的基因片段克隆到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。測序驗證后再分別插入載體pTRV2中，獲得重組VIGS載體pTRV2-ZmPDS和pTRV2-ZmMAC3，測序驗證正確后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 農(nóng)桿菌菌液的制備 將質(zhì)粒pTRV1、pTRV2-ZmPDS、pTRV2-ZmMAC3分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。分別挑取陽性農(nóng)桿菌單菌落，接種至2 mL含有50 mg·mL-1卡那霉素(Kan)和50 mg·mL-1利福平(Rif)的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h，菌液PCR檢測正確后，再將菌液以1∶100的體積比轉(zhuǎn)接至50 mL含50 mg·mL-1Kan和50 mg·mL-1Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4左右，將各菌液的OD600值調(diào)整至一致。

將上述含pTRV1的農(nóng)桿菌分別與含有pTRV2-ZmPDS、pTRV2-ZmMAC3的農(nóng)桿菌菌液以1∶1體積比混合，在所得混合菌液中加入AS(19.62 mg·L-1)、Cys(400 mg·L-1)和Tween 20(5 mL·L-1)，搖晃混勻后得到VIGS轉(zhuǎn)化菌液備用[13]。

1.2.3 農(nóng)桿菌真空滲入及共培養(yǎng)VIGS Zhang等[13]報道真空輔助農(nóng)桿菌滲入TRV-VIGS方法包括真空滲入、種子-農(nóng)桿菌共培養(yǎng)兩個主要步驟。本研究在此基礎(chǔ)上增加浸種環(huán)節(jié)，并對真空滲入時間、種子-農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間等進(jìn)行優(yōu)化。具體方法如下：玉米種子用70%酒精浸泡1 min、2.5%次氯酸鈉浸泡10 min、無菌水沖洗5次進(jìn)行消毒。以不浸種為對照，分別設(shè)置加無菌水和VIGS轉(zhuǎn)化菌液28℃浸種24 h 2個浸種處理；用手術(shù)刀片將上述處理的種子種皮劃破放入組培瓶中，再加入40 mL VIGS轉(zhuǎn)化菌液，使種子完全浸泡其中，真空輔助滲入20、40、60 min 3種處理；種子-農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時間設(shè)為10 h和15 h 2個處理(28℃，150 r·min-1)。以上處理所用農(nóng)桿菌為GV3101、LB4 404 2種菌株。最后用無菌水將玉米種子沖洗干凈，播于營養(yǎng)土中，溫室(溫度25℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗)生長14 d后觀察植株表型并對靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。以無菌水代替上述VIGS轉(zhuǎn)化菌液為空白對照。

1.2.4 半定量RT-PCR檢測 提取玉米葉片RNA，利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ kit 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為RT-PCR分析的模板。以玉米Actin(J01238，引物Actin-F：5′-CAATGGCACTGGAATGGT-3′；Actin-R：5′-ATCTTCAGGCGAAACACG-3′)作為內(nèi)參基因，對不同樣品模板進(jìn)行均一化處理。然后利用ZmPDS基因特異引物(ZmPDS-RT-F：5′-AGGTCGTGGTTGCTGGTGC-3′；ZmPDS-RT-R：5′-ATTCTCCTGGCTTGTTTGG-3′)和ZmMAC3基因特異引物(ZmMAC3-RT-F：5′-AGAAGGAAAGAGATGAGG-3′；ZmMAC3-RT-R：5′-TGAGTGACCAGTAAGCGT-3′)，對不同處理樣品中的ZmPDS和ZmMAC3基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行半定量RT-PCR分析。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共28個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 亞粘團(tuán)鐮孢菌接種及玉米頂腐病菌抗性鑒定 將亞粘團(tuán)鐮孢菌接種至固體馬鈴薯培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至長滿培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至液體馬鈴薯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5～7 d，紗布過濾，濾液即為孢子懸浮液，用無菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×107cfu·mL-1[19]。

將采用真空輔助VIGS農(nóng)桿菌液處理的玉米種子播種，待其生長至第一片真葉即將展開時，將亞粘團(tuán)鐮孢菌孢子懸浮液浸泡玉米根部10 min，溫室中繼續(xù)生長7 d后，參照孟有儒等[19]的方法進(jìn)行玉米頂腐病表型鑒定。以pTRV1/pTRV2-ZmPDS為VIGS陽性對照，pTRV1/pTRV2:00為ZmMAC3基因的VIGS陰性對照，分析pTRV1/pTRV2-ZmMAC3對玉米頂腐病抗性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米PDS、MAC3基因VIGS沉默載體的構(gòu)建

提取玉米幼苗的葉片RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，分別獲得大小為315 bp的ZmPDS目的片段和500 bp的ZmMAC3目的片段?？寺y序后，BLAST核酸序列比對結(jié)果與玉米B73 GRMZM2G410515和GRMZM2G037698的相似度分別為99%和100%，VIGS靶標(biāo)基因序列同源性大于85%即可引起有效的基因沉默[20-21]，因此，ZmPDS和ZmMAC3可應(yīng)用于VIGS試驗。將測序驗證正確的VIGS靶標(biāo)片段插入pTRV2載體中，經(jīng)XbaⅠ與BamHI 雙酶切驗證后，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101和LB4404感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR驗證后，保存?zhèn)溆?圖1、圖2)。

注：M：2 000 bp marker；1：ZmPDS靶標(biāo)基因片段擴(kuò)增；2：pTRV2-ZmPDS重組質(zhì)粒酶切驗證；3～4：農(nóng)桿菌菌液PCR驗證。Note：M：2 000 bp marker. 1：Amplification of ZmPDS gene fragments. 2：Double enzyme cutting validation of pTRV2-ZmPDS recombinant plasmid. 3-4：PCR validation of Agrobacterium bacteria.圖1 玉米ZmPDS基因片段的擴(kuò)增和VIGS沉默載體的酶切鑒定Fig.1 Amplification of ZmPDS gene of maize and identification of the VIGS silencing vector

注：M：5 000 bp marker；1：ZmMAC3靶標(biāo)基因片段擴(kuò)增；2：pTRV2-ZmMAC3重組質(zhì)粒酶切驗證；3～4：農(nóng)桿菌菌液PCR驗證。Note：M：5 000 bp marker. 1：Amplification of ZmMAC3 gene fragments. 2：Double enzyme cutting validation of pTRV2-ZmMAC3 recombinant plasmid. 3-4：PCR validation of Agrobacterium bacteria.圖2 玉米ZmMAC3基因片段的擴(kuò)增和VIGS沉默載體的酶切鑒定Fig.2 Amplification of ZmMAC3 gene of maize and identification of the VIGS silencing vector

2.2 玉米TRV-VIGS體系的優(yōu)化

穩(wěn)定、高效、高通量的VIGS體系，是將其應(yīng)用于玉米抗病基因功能快速鑒定的基本條件。本研究首先完全遵照Zhang等[13]的方法，驗證了應(yīng)用該方法沉默玉米ZmPDS基因引起的白化表型的效率及其重復(fù)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZmPDS基因可以被沉默，并引起整株完全白化，但沉默白化植株的比例僅3%，效率較低，難以實際應(yīng)用。因此，分別從浸種方法、農(nóng)桿菌菌株篩選、真空滲入時間、共培養(yǎng)時間等因素對該體系進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 浸種方式的篩選 Zhang等[13]將消毒處理后的玉米種子不經(jīng)浸種直接進(jìn)行農(nóng)桿菌輔助真空滲入處理，觀察發(fā)現(xiàn)干燥種子可能不利于農(nóng)桿菌侵入，因此，本試驗分別使用無菌水、VIGS農(nóng)桿菌液浸泡玉米種子24 h。結(jié)果表明，不浸種處理，VIGS沉默玉米存活率為80.0%，基因沉默效率為3.0%；VIGS農(nóng)桿菌和無菌水浸種處理，存活率分別降低為51.0%和54.0%，而ZmPDS基因沉默比率(白化率)分別上升至15.9%和28%，浸種處理明顯提高了VIGS沉默效率，無菌水處理組的沉默效率最高，是不浸種的9倍以上(圖3-A)。因此，無菌水浸種24 h，再接種農(nóng)桿菌是最佳種子預(yù)處理條件。

2.2.2 農(nóng)桿菌菌株的篩選 選用2種不同的農(nóng)桿菌菌株GV3101和LB4404，分別進(jìn)行真空滲入輔助農(nóng)桿菌侵染無菌水浸種24 h后的玉米種子，結(jié)果表明，GV3101和LB4404處理的玉米幼苗存活率分別為53.8%、50.4%，不同農(nóng)桿菌菌株對玉米幼苗存活率影響無明顯差異(P>0.05)，GB3101和LB4404處理的基因沉默效率分別為14.2%和29.3%，LB4404的基因沉默效率是GV3101的2倍以上(圖3-B)。表明，選用農(nóng)桿菌LB4404菌株可以獲得更高的VIGS沉默效率。

圖3 玉米TRV-VIGS體系的優(yōu)化Fig.3 Optimization of maize TRV-VIGS system

2.2.3 真空滲入時間的優(yōu)化 Zhang等[13]使用20 mL注射器和10 mL醫(yī)用玻璃瓶進(jìn)行抽真空滲入60 s，結(jié)果發(fā)現(xiàn)真空處理時間短，農(nóng)桿菌侵染可能不夠充分，而且試驗所用器具容量小，不利于大規(guī)模處理種子，因此，本試驗改用真空干燥器，并對真空輔助農(nóng)桿菌滲入時間進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置抽真空20、40、60 min 3個處理。結(jié)果表明，基因沉默效率隨真空滲入時間的延長而增加，分別為17.0%、24.1%和25.1%；但幼苗存活率隨著真空滲入時間延遲呈先降低后增加的趨勢，當(dāng)抽真空20 min處理時存活率最高，為54.0%；真空滲入60 min處理時，存活率達(dá)45.3%；農(nóng)桿菌抽真空滲入60 min處理可以獲得最高的基因沉默效率，同時維持較高的幼苗存活率(圖3-C)。

2.2.4 農(nóng)桿菌-玉米種子共培養(yǎng)時間的優(yōu)化 研究表明，將農(nóng)桿菌與玉米種子進(jìn)行共培養(yǎng)，玉米的存活率和基因沉默效率均受共培養(yǎng)時間的顯著影響，15 h時基因沉默效率較好[13]。本試驗設(shè)置共培養(yǎng)時間為10 h和15 h 2個處理，結(jié)果表明，共培養(yǎng)時間對植株的存活率無明顯影響，分別為46.2%和45.2%，植株的基因沉默效率隨共培養(yǎng)時間延長而略有降低，分別為23.9%和20.1%(圖3-D)。因此，10 h處理為最佳共培養(yǎng)時間。

綜上，優(yōu)化后的基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米TRV-VIGS體系，包括無菌水浸種24 h后，手術(shù)刀將種皮劃破，真空輔助農(nóng)桿菌LB4404菌液滲入處理玉米種子60 min后共培養(yǎng)10 h，洗凈種子后播種，溫室生長。

2.3 利用TRV-VIGS體系鑒定ZmMAC3基因在玉米頂腐病抗性中的作用

注：A：PTRV1/pTRV2:00對照植株；B：用含pTRV1/pTRV2-ZmPDS農(nóng)桿菌侵染的植株；C：半定量RT-PCR分析ZmPDS基因的表達(dá)；D：接種頂腐病菌7 d后，pTRV2:00對照植株；E：接種頂腐病菌7 d后，含pTRV1/pTRV2-ZmMAC3農(nóng)桿菌侵染的植株(左一、二：感病植株，右一、二：未感病植株)；F：半定量RT-PCR分析ZmMAC3基因的表達(dá)。CK：無菌水處理植株；1和4：pTRV2:00侵染植株中ZmPDS和ZmMAC3基因的相對表達(dá)；2和3：pTRV2-ZmPDS沉默植株中ZmPDS基因的相對表達(dá)；5和6：感病植株中ZmMAC3基因的相對表達(dá)；7和8：未感病植株 中ZmMAC3基因的相對表達(dá)。Note: A: pTRV1/pTRV2:00 control plants. B: Plants treated with pTRV1/pTRV2-ZmPDS Agrobacterium tumefaciens. C: Semi-quantitative RT-PCR analysis of ZmPDS gene expression. D: pTRV2:00 control plants infected with the top rot pathogen for 7 d. E: Plants inoculated with pTRV1/pTRV2-ZmMAC3 after infected with the top rot pathogen for 7 d (left one and two: the diseased plants, right one and two: undiseased plants). F: Semi-quantitative RT-PCR analysis of ZmMAC3 gene expression. CK: Sterile water treated plants. 1 and 4: Plants infected with pTRV2:00 and the relative expression of ZmPDS and ZmMAC3. 2 and 3: Relative expression of ZmPDS gene in plants silenced by pTRV2-ZmPDS. 5 and 6: Relative expression of ZmMAC3 gene in susceptible plants. 7 and 8: Relative expression of ZmMAC3 gene in unaffected plants.圖4 TRV介導(dǎo)的玉米VIGS體系及半定量RT-PCR檢測Fig.4 TRV mediated VIGS system in maize and detection by semi-quantitative RT-PCR

MAC3是植物先天免疫和抗病信號通路中的關(guān)鍵因子，為了驗證TRV-VIGS方法實際應(yīng)用的可行性，同時初步分析ZmMAC3在玉米頂腐病抗性中的作用，利用優(yōu)化的玉米TRV-VIGS體系，以抗頂腐病品種先玉335為研究材料，以接種pTRV1/pTRV2-ZmPDS農(nóng)桿菌為VIGS對照、以接種pTRV1/pTRV2:00農(nóng)桿菌進(jìn)行VIGS沉默處理后接種亞粘團(tuán)鐮孢菌為對照，觀察接種pTRV1/pTRV2-ZmMAC3農(nóng)桿菌VIGS沉默處理再接種亞粘團(tuán)鐮孢菌后玉米頂腐病抗性表現(xiàn)。結(jié)果表明，接種VIGS處理14 d后，pTRV1/pTRV2:00農(nóng)桿菌侵染種子的玉米幼苗未出現(xiàn)白化表型，葉片仍為綠色(圖4-A)；pTRV1/pTRV2-ZmPDS農(nóng)桿菌侵染種子的玉米幼苗出現(xiàn)整株完全白化表型(圖4-B)；RT-PCR半定量分析結(jié)果表明，白化玉米植株中ZmPDS轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對照(圖4-C)，說明ZmPDS得到了有效沉默。pTRV1/pTRV2:00農(nóng)桿菌侵染的植株，接種亞粘團(tuán)鐮孢菌后，玉米幼苗正常生長，沒有明顯病癥表現(xiàn)(圖4-D)，表明先玉335對頂腐病具有較強(qiáng)的抗性；而VIGS沉默ZmMAC3的先玉335接種亞粘團(tuán)鐮孢菌后部分幼苗表現(xiàn)出生長緩慢，植株矮小，葉尖變黃干枯，頂端葉片或心葉卷曲纏繞等典型的玉米頂腐病癥狀(圖4-E)；半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，VIGS沉默處理的植株中表現(xiàn)典型頂腐病病癥的個體的ZmMAC3轉(zhuǎn)錄水平均較低，而未表現(xiàn)病癥的單株ZmMAC3轉(zhuǎn)錄水平接近正常對照水平(圖4-F)。表明ZmMAC3是玉米頂腐病抗性所必需的重要基因。將單株表型鑒定與沉默基因RNA水平的定量或半定量分析相結(jié)合，可以應(yīng)用于玉米功能基因的VIGS分析鑒定。

3 討論

目前已有40多種病毒被改造為VIGS載體，其中約37種可以應(yīng)用于雙子葉植物基因沉默[7-8]，而適用于單子葉植物的VIGS載體卻僅有幾個。BSMV、BMV是目前廣泛應(yīng)用于禾谷類植物基因功能的VIGS工具，但它們的接種方式高度依賴于基因槍[22]、體外轉(zhuǎn)錄摩擦接種[21, 23-24]或在本氏煙草這樣的中介宿主植物預(yù)接種[25]。據(jù)報道BMV[24]、CMV、ZMBJ-CMV[10]、FoMV[11-12]已成功應(yīng)用于玉米VIGS，但是沉默ZmPDS基因只能導(dǎo)致部分白化癥狀，說明玉米這些VIGS體系可能不能作用于整株水平，持續(xù)時間短。雖然有利用BMV載體通過農(nóng)桿菌真空滲入法成功沉默水稻基因的報道，但是未見應(yīng)用報道。TRV應(yīng)用于VIGS試驗具有接種簡便、無需RNA操作、試驗周期短等優(yōu)點，已在番茄[26]、煙草[27]、擬南芥[28]、麻風(fēng)樹、矮牽牛[29]、棉花[30]等雙子葉植物上成功應(yīng)用，但極少應(yīng)用于單子葉植物。最近，Zhang等[13]通過農(nóng)桿菌真空滲入與共培養(yǎng)相結(jié)合將TRV-VIGS體系成功應(yīng)用于小麥和玉米基因的沉默，克服了BMV、CMV、FoMV、BSMV等介導(dǎo)的VIGS的缺點，可在整株植物水平上起作用。此外，該方法通過種子處理，由農(nóng)桿菌介導(dǎo)，還可以克服傳統(tǒng)的TRV-VIGS采用的葉片接種農(nóng)桿菌難以完全抑制整個植物水平的基因轉(zhuǎn)錄消減，以及難以通過VIGS沉默研究注射葉片以下(根、下胚軸等)組織以及植物早期發(fā)育的基因功能等不足。但是Zhang等[13]報道的方法，只適用于處理少數(shù)幾粒種子，而在本試驗條件下，沉默ZmPDS的比例僅3.0%，很難實際應(yīng)用。因此，本試驗從浸種處理、農(nóng)桿菌菌株、真空滲入時間、共培養(yǎng)時間等試驗條件因素進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的玉米TRV-VIGS體系無論沉默ZmPDS導(dǎo)致植株出現(xiàn)光漂白癥狀的比率，還是沉默ZmMAC3后接種亞粘團(tuán)鐮孢菌而引起抗頂腐病玉米品種先玉335感染發(fā)病的比例均穩(wěn)定在25%以上，而且表現(xiàn)光漂白或感病癥狀的植株其對應(yīng)植株中的ZmPDS或ZmMAC3的轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低，而不表現(xiàn)沉默癥狀的單株對應(yīng)的ZmPDS或ZmMAC3的轉(zhuǎn)錄水平都無明顯變化，基因的轉(zhuǎn)錄水平與癥狀之間出現(xiàn)高度相關(guān)性。因此，將單株表型鑒定與VIGS沉默基因的轉(zhuǎn)錄水平分析相結(jié)合，可以應(yīng)用于玉米基因功能的鑒定。

TRV-VIGS體系的沉默效率取決于病毒的繁殖傳播與植物生長之間的動態(tài)互作[31]。TRV通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入玉米細(xì)胞，表達(dá)TRV病毒，因此影響農(nóng)桿菌侵入玉米組織的試驗條件因素可能起決定性作用。本研究也證實了這一觀點，即農(nóng)桿菌菌株、浸種方法、真空滲入時間和共培養(yǎng)時間均對VIGS效率產(chǎn)生了不同程度的影響。真空輔助農(nóng)桿菌滲入法能夠增加植物遺傳轉(zhuǎn)化效率，尤其適用于對真空滲入具有高抗性的植物[32]。玉米種子能夠承受長時間真空滲透，本研究中真空滲入時間長達(dá)60 min，雖然育種種子存活率下降，但基因沉默效率最佳。干燥的種子不利于農(nóng)桿菌侵染，所以本試驗采用了無菌水和農(nóng)桿菌浸種的方法，先浸種，再進(jìn)行真空滲透，VIGS沉默效率大幅度提高，是改良的玉米TRV-VIGS體系最關(guān)鍵的步驟。將玉米種子與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)適當(dāng)時間，可以增加受侵染植物細(xì)胞的比例，提高VIGS基因沉默效率，但共培養(yǎng)時間過長時VIGS的效率反而降低，這是否是由于農(nóng)桿菌過度老化，活性下降，導(dǎo)致沉默效率降低還有待進(jìn)一步研究。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)LB4404對玉米基因沉默的效率較高，可能與植物對不同農(nóng)桿菌菌株具有不同的敏感性有關(guān)[33-34]，而容易侵染的玉米受體則有利于病毒RNA的轉(zhuǎn)錄，從而提高VIGS沉默效率。但本研究所使用的受體玉米品種和農(nóng)桿菌菌株種類有限，下一步可擴(kuò)大受體玉米品種的篩選范圍和農(nóng)桿菌菌株種類以提高VIGS有效沉默效率。本研究中，優(yōu)化后的TRV-VIGS體系的沉默效率最高也只有29.3%，雖然結(jié)合單株目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測可以鑒定基因的功能，但是70%以上沒有沉默的植株可能會給沉默基因的表型鑒定帶來困擾，同時，轉(zhuǎn)錄水平分析的工作量較大。因此，需要進(jìn)一步改良。pTRV1和pTRV2都是使用兩個串聯(lián)35S啟動子啟動TRV和插入靶標(biāo)基因部分序列的RNA轉(zhuǎn)錄；35S啟動子在單子葉植物中是一種較弱的啟動子，因而也可能影響VIGS效率；pUbi啟動子在玉米中的啟動效率是35S的10倍以上，以pUbi取代35S啟動子也有可能大幅度提高TRV-VIGS在單子葉植物中的效率[35]。

MAC是植物剪接體中的起活化和調(diào)控作用的重要組分，對于RNA剪接和miRNA合成等具有重要調(diào)控作用。擬南芥突變體mac3a和mac3b以及VIGS沉默棉花GhMAC3都能導(dǎo)致植物免疫或抗病能力顯著下降，但是它們在單子葉植物中免疫和抗病作用尚未見報道。先玉335高抗玉米頂腐病。本研究利用優(yōu)化的TRV-VIGS技術(shù)沉默玉米中同源基因mMAC3，發(fā)現(xiàn)ZmMAC3沉默后的植株對亞粘團(tuán)鐮孢菌高度敏感，表現(xiàn)出葉尖變黃干枯，頂端葉片或心葉卷曲纏繞等典型的玉米頂腐病癥狀，優(yōu)化后的玉米TRV-VIGS體系可以實際應(yīng)用于玉米苗期抗病基因的功能分析。表明，MAC和MAC3在單子葉植物免疫和抗病反應(yīng)中可能同樣起關(guān)鍵作用，這為進(jìn)一步研究玉米MAC參與的免疫分子機(jī)制提供了一定的理論參考。

4 結(jié)論

本研究從浸種處理、農(nóng)桿菌菌株、真空滲入時間、共培養(yǎng)時間4個試驗因素對玉米TRV-VIGS體系進(jìn)行優(yōu)化，得到高效、穩(wěn)定的VIGS體系，包括無菌水浸泡種子24 h后，剝?nèi)ヅ卟糠N皮，LB4404農(nóng)桿菌菌株真空滲入處理60 min，再共培養(yǎng)10 h。應(yīng)用該體系，成功抑制了玉米ZmMAC3基因表達(dá)，與對照相比，ZmMAC3抑制表達(dá)的玉米植株接頂腐病菌后，更易感病。優(yōu)化的玉米TRV-VIGS體系具體快速、高效、可使植株整株沉默等特點。本研究結(jié)果為玉米重要基因鑒定和功能分析的研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。