男性染色體多態(tài)性對IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局的影響*

劉珊， 史霖， 王婷**

(1.西北婦女兒童醫(yī)院 輔助生殖中心， 陜西 西安 710003; 2.西安交通大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系， 陜西 西安 710061)

染色體多態(tài)性(chromosome polymorphism)指不同個體間異染色質(zhì)區(qū)存在恒定的微小變異，主要包括常染色體(1、9、16號染色體)長臂次縊痕長度變異、D/G組染色體隨體及隨體柄變異、9號染色體臂間倒位及Y染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)長度變異等[1]。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為此類變異不會引起表型效應(yīng),但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)染色體多態(tài)性可能與生殖異常如流產(chǎn)、死胎、胚胎停育、男性不育及精子異常等有關(guān)[1-3]。染色體多態(tài)性對輔助生殖妊娠結(jié)局的影響一直存在爭議，有學(xué)者認(rèn)為染色體多態(tài)性會增加早期流產(chǎn)率[4-6]，降低臨床妊娠率及活產(chǎn)率[6-9]，對體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局造成不良影響，但也有研究結(jié)果顯示染色體多態(tài)性對輔助生殖妊娠結(jié)局無影響[1,10-18]，這些研究所得到不同的結(jié)論可能與納入的樣本量、各型染色體多態(tài)性所占比例以及統(tǒng)計學(xué)方法的不同有關(guān)。本研究收集2014年1月-2018年3月西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心接受體外受精/單精子顯微注射并胚胎移植(IVF/ICSI-ET)治療的男方染色體多態(tài)性不孕癥夫婦的相關(guān)數(shù)據(jù)，分析男性常染色體長臂次縊痕長度、D/G組染色體隨體及隨體柄、9號染色體臂間倒位及Y染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)長度等變異對體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的影響，同時分析妊娠異常(早期流產(chǎn)和胚胎停止發(fā)育)、臨床妊娠和活產(chǎn)的相關(guān)影響因素，以探討不同類型男性染色體多態(tài)性對IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2014年1月-2018年3月首次接受IVF/ICSI-ET治療的不孕夫婦作為研究對象,包括單純男方染色體多態(tài)患者。根據(jù)不同的染色體多態(tài)類性分為男性常染色體長臂次縊痕多態(tài)、D/G組染色體隨體多態(tài)、9號染色體臂間倒位和Y染色體多態(tài)4組；同期行IVF/ICSI-ET助孕、且男女雙方染色體均正常的夫婦作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)夫婦雙方均≤38歲，(2)女方生殖系統(tǒng)解剖無異常，(3)女方體質(zhì)量指數(shù)(BMI) 18～25 kg/m2，(4)女方基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)<15 IU/L、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)>5。排除標(biāo)準(zhǔn): (1)女方合并復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、輸卵管積水、子宮內(nèi)膜息肉、多囊卵巢綜合征以及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病，(2)男方嚴(yán)重的精索靜脈曲張癥以及嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病等，(3)男方AZF(azoospermia factor)檢查存在微缺失，(4)女方為染色體多態(tài)性，(5)男方同時合并兩種以上染色體多態(tài)性。該研究過程符合1964 Helsinki宣言的精神，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號2018012)。

1.2 方法

1.2.1染色體核型分析 接受IVF/ICSI-ET治療前采集患者外周血，分離淋巴細胞,體外培養(yǎng)72 h，收集淋巴細胞制備染色體及G顯帶分析。根據(jù)人類細胞學(xué)國際命名體制(ISCN2009)進行染色體核型分析。每例至少分析30個中期染色體核型，如有嵌合體存在，則分析100個中期染色體核型。

1.2.2IVF/ICSI-ET助孕 依據(jù)患者年齡、卵巢儲備功能情況選擇促排卵方案，根據(jù)卵泡發(fā)育情況和血清激素水平調(diào)整促性腺激素(Gn)藥量，當(dāng)一個主導(dǎo)卵泡直徑>18 mm或2個主導(dǎo)卵泡直徑>17 mm時，注射重組人絨毛膜促性腺激素(hCG，艾澤，默克雪蘭諾)，36 h后陰道超聲介導(dǎo)下取卵。根據(jù)實驗室操作常規(guī)進行IVF/ICSI-ET，每個周期移植1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎，術(shù)后黃體支持。卵巢過度刺激綜合征(OHSS)高風(fēng)險者取消新鮮移植，行全胚冷凍，未獲卵者不納入本研究。移植術(shù)后30 d行陰道B超檢查，見孕囊即為臨床妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)

分析各組患者基本情況、基礎(chǔ)性激素水平、促排卵情況及妊娠結(jié)局。記錄下列指標(biāo)：IVF受精正常受精率=每周期2PN受精卵數(shù)目/每周期獲卵數(shù)×100%，ICSI受精正常受精率=每周期2PN受精卵數(shù)目/每周期MⅡ卵子數(shù)×100%，優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%，移植取消率=取消移植周期數(shù)/總周期數(shù)×100%，異常妊娠率=(早期流產(chǎn)數(shù)+胚胎停止發(fā)育數(shù))/臨床妊娠數(shù)×100%，早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/分娩周期數(shù)×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=有活產(chǎn)嬰兒出生的分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。同時采用Logistic回歸分析與異常妊娠發(fā)生、成功臨床妊娠和活產(chǎn)相關(guān)的影響因素，協(xié)變量包括各型男方染色體多態(tài)性、女方年齡、男方年齡、女方BMI、內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)雌激素(E2)、基礎(chǔ)黃體生成素(LH)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)、Gn用量、受精方式(ICSI或IVF)、促排方案(短方案或長方案)、獲卵數(shù)、MII卵數(shù)、正常受精率、可移植胚胎數(shù)、優(yōu)胚數(shù)和移植胚胎數(shù)。將孕12周前的妊娠終止(流產(chǎn)、或胚胎停止發(fā)育)定義為異常妊娠。分娩后隨訪出生嬰兒數(shù)、生產(chǎn)方式、是否足月、性別、出生體重、孕周及先天畸形情況等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本情況

本研究共入組患者1 936對夫婦，對照組1 596對夫婦，患者男性常染色體長臂次縊痕多態(tài)組84對(38例1qh+、26例9qh+及20例16qh+)，D/G組染色體隨體多態(tài)組81對(2例13ps+、1例13pss、7例13pstk+、3例14ps+、1例14pss、8例14pstk+、3例15ps+、1例15pss、8例15pstk+、2例21ps+、2例21pss、22例21pstk+、4例22ps+及17例22pstk+)，9號染色體臂間倒位組25對[均為inv(9)]，Y 染色體多態(tài)組150對(22例Yqh-、128例Yqh+)。4個染色體多態(tài)組與正常對照組比較，男女年齡、不孕年限、女方BMI、內(nèi)膜厚度、基礎(chǔ)激素水平及Gn用量等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，4個染色體多態(tài)組的平均精液濃度和精液活率雖均較對照組降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組受試者基本情況和基礎(chǔ)性激素水平Tab.1 General condition and basic sex hormone levels in all groups of subjects

2.2 促排卵、受精及妊娠結(jié)局

與正常對照組比較，常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)組、Y染色體多態(tài)組臨床妊娠率降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；4個染色體多態(tài)組的活產(chǎn)率較對照組低，異常妊娠率(早期流產(chǎn)和停止發(fā)育)較對照組增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；5組促排卵、受精及妊娠結(jié)局的其余指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組受試者促排情況及妊娠結(jié)局Tab.2 Exclusion promotion conditions and pregnancy outcomes in all groups of subjects

注：N此指標(biāo)下的總例數(shù),n為發(fā)生數(shù)

2.3 異常妊娠、臨床妊娠及活產(chǎn)相關(guān)因素分析

二分類Logistic回歸分析結(jié)果顯示，9號染色體臂間倒位和女方年齡與異常妊娠(早期流產(chǎn)和胚胎停止發(fā)育)的發(fā)生呈顯著正相關(guān)；Y染色體多態(tài)、女方年齡與成功臨床妊娠呈負(fù)相關(guān)，內(nèi)膜厚度、獲MII卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)和移植胚胎數(shù)與成功臨床妊娠呈正相關(guān)；常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)、Y染色體多態(tài)、女方年齡和短方案使用與成功活產(chǎn)呈負(fù)相關(guān)，內(nèi)膜厚度、獲MII卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)和移植胚胎數(shù)與成功活產(chǎn)呈正相關(guān)。見表3。

表3 異常妊娠、臨床妊娠及活產(chǎn)相關(guān)性因素的Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis on related factors of abnormal pregnancy,clinical pregnancy and live birth

3 討論

隨著輔助生育技術(shù)的廣泛應(yīng)用，治療中檢測到行輔助生殖技術(shù)助孕的患者中染色體多態(tài)的發(fā)生率顯著高于普通人群，尤以男性更加明顯[2,19]。但目前對男性染色體多態(tài)對生殖功能的影響尚存在爭議,有的研究發(fā)現(xiàn)男性染色體多態(tài)性會對IVF/ICSI-ET助孕結(jié)局造成不良影響[4-9]，有的研究則顯示男性染色體多態(tài)性對輔助生殖妊娠結(jié)局無影響[1,10-18]。造成這些矛盾結(jié)果的一個重要原因為大多數(shù)研究并未根據(jù)男性染色體多態(tài)發(fā)生的不同類型，將不同類型的染色體多態(tài)性分開研究，而是將多種不同類型的染色體多態(tài)樣本混合在一起研究，由于不同類型染色體多態(tài)對生殖功能的影響可能不同，且各研究中不同類型染色體多態(tài)樣本比例存在差異，因此造成研究結(jié)果產(chǎn)生較大偏差。

不同的統(tǒng)計分析方法也會造成研究結(jié)果的差異。在輔助生殖妊娠結(jié)局的研究中，大多采用χ2檢驗比較組間流產(chǎn)率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率等妊娠結(jié)局的差異顯著性，往往由于樣本例數(shù)較少，雖然百分率存在明顯差異，但統(tǒng)計學(xué)卻無顯著性差異，本研究中，常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)組和Y染色體多態(tài)組中臨床妊娠率和活產(chǎn)率均低于對照組10%左右，9號染色體臂間倒位組的異常妊娠率則較對照組高近4倍，但χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，如活產(chǎn)率等數(shù)據(jù)是總活產(chǎn)周期數(shù)與總移植胚胎周期數(shù)的比值，模糊了每個周期樣本的特性，不利于相關(guān)差異因素的發(fā)現(xiàn)，因此如采用如Logistic回歸分析這樣的相關(guān)性分析方法，則能更準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)影響妊娠結(jié)局的相關(guān)因素。

本研究首次回顧性分析了不同類型男性染色體多態(tài)患者IVF/ICSI助孕的臨床結(jié)局，同時對采用Logistic回歸分析對造成不同妊娠結(jié)局的相關(guān)影響因素進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9號染色體臂間倒位與異常妊娠的發(fā)生呈正相關(guān)，常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)和Y染色體多態(tài)則與成功活產(chǎn)呈負(fù)相關(guān)，表明男性9號染色體臂間倒位會增加異常妊娠的發(fā)生率，而男方常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)和Y染色體多態(tài)則會降低活產(chǎn)率。

9號染色體臂間倒位[inv(9)]是一種較常見的染色體變異，男性9號染色體臂間倒位會形成4種不同的精子，一種為正常染色體，一種為倒位染色體，其余兩種均為帶有部分重復(fù)和部分缺失的重排染色體。當(dāng)含重組染色體的精子與正常卵子受精后，會造成遺傳物質(zhì)出現(xiàn)缺失或重復(fù)，從而造成流產(chǎn)、死胎等生殖異常。不少臨床對照研究認(rèn)為,在各類型染色體多態(tài)性中inv(9)較易引起流產(chǎn)、死胎、后代異常等臨床表現(xiàn)[20]。本研究中也發(fā)現(xiàn)inv(9)是引起異常妊娠(早期流產(chǎn)+停止發(fā)育)的高危因素，但inv(9)并未對臨床妊娠率及活產(chǎn)率造成影響，這與國內(nèi)多篇研究報道結(jié)果一致[12-14]。

1、9及16 號常染色體次縊痕區(qū)異染色體長度增加(qh+)，可造成遠端染色體片段重復(fù)，導(dǎo)致同源染色體配對困難，可產(chǎn)生不平衡的配子[11]，同時異染色體長度增加還可能引起相鄰基因的表觀遺傳學(xué)改變，甚至導(dǎo)致基因沉默[21]。本研究發(fā)現(xiàn)1、9及16號常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)與成功活產(chǎn)呈負(fù)相關(guān)，顯示其為正常妊娠的不利因素。此外，本研究中雖發(fā)現(xiàn)常染色體次縊痕區(qū)多態(tài)組中異常妊娠率較對照組要高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，回歸分析也未發(fā)現(xiàn)其是異常妊娠發(fā)生的正相關(guān)因素，此結(jié)果與Minocherhomji等[10]的研究結(jié)果一致。

Y染色體長臂DNA過多的重復(fù)可能影響減數(shù)分裂時X-Y配對聯(lián)會[22]，此外Y染色體長臂增加可能會抑制與精子分化及發(fā)育相關(guān)基因的正常表達，導(dǎo)致精子生成障礙并影響精子的受精能力[10,23]。Y染色體中異染色質(zhì)的缺失則可能致使常染色質(zhì)排列松散，導(dǎo)致精子生成異常[23]。本研究中，并未發(fā)現(xiàn)在Y染色體多態(tài)組中正常受精率較對照組有所降低，其原因可能是人工體外受精技術(shù)一定程度上彌補Y染色體多態(tài)患者精子生成障礙和受精能力低的缺陷。本研究發(fā)現(xiàn)Y染色體多態(tài)與成功臨床妊娠和活產(chǎn)均呈負(fù)相關(guān)，顯示其為正常妊娠的不利因素，此結(jié)果與一些研究報道相一致[6-7]，但與另一些報道不一致[14-16]，不一致原因可能與統(tǒng)計學(xué)方法及這幾項研究的樣本例數(shù)較小有關(guān)。

D/G組染色體隨體增加可能導(dǎo)致端著絲粒染色體的不分離，造成胚胎發(fā)生染色體非整倍性變異，或造成減數(shù)分裂中產(chǎn)生異常配子，從而增加流產(chǎn)發(fā)生幾率[24]。本研究中雖然觀察到D/G 組染色體隨體多態(tài)性組中平均正常受精率和異常妊娠率均較對照組有所降低，但均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與樣本例數(shù)較少有關(guān)。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)D/G 組染色體隨體多態(tài)與臨床妊娠結(jié)局具有相關(guān)性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在IVF/ICSI-ET治療中，男性1、9及16號常染色體長臂次縊痕長度變異、9號染色體臂間倒位和Y染色體長臂異染色質(zhì)區(qū)長度變異，均是造成不良妊娠結(jié)局的影響因素，男性患者存在這些染色體多態(tài)可能增加輔助生殖助孕患者發(fā)生不良妊娠的風(fēng)險。