鹽酸小檗堿對高脂喂養(yǎng)大鼠棕色脂肪組織PGC-1α及UCP-1基因表達(dá)的影響*

喻日成， 范元碩， 羅建華

(貴州省人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 貴州 貴陽 550002)

脂肪組織在能量的代謝中具有起重要作用，白色脂肪組織儲存甘油三酯、通過脂解后提供脂肪酸，棕色脂肪組織通過激活解偶聯(lián)蛋白-1(UCP-1)及線粒體β氧化分解脂肪酸提供熱量[1-2]。UCP-1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助因子(PGC-1α)在棕色脂肪組織中表達(dá)豐富，可作為輔助因子與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)和甲狀腺受體β(TRβ)結(jié)合、并作用于UCP-1啟動子，與肥胖的發(fā)生關(guān)系密切[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，鹽酸小檗堿不僅具有解熱、抗炎的作用，還具有改善胰島素抵抗的作用[5-6]。目前鹽酸小檗堿改善胰島素抵抗的機(jī)制尚不明確，本研究觀察鹽酸小檗堿對肥胖大鼠棕色脂肪組織形態(tài)及功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

6周齡Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，初始體質(zhì)量70～80 g，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物中心提供；RNA提取試劑盒(QIAGEN)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems)， LightCycler?TaqMan?Master(Roche)，UCP-1一抗(Santa Cruz)，PGC-1α一抗(acam)，辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的二抗(nta Cruz)。

1.2 方法

1.2.1分組 SD雄性大鼠隨機(jī)分為對照組、高脂喂養(yǎng)組及鹽酸小檗堿組，每組8只。對照組大鼠喂基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)22%，脂肪12%，碳水化合物66%)、高脂喂養(yǎng)組和鹽酸小檗堿組大鼠喂高脂飼料(蛋白質(zhì)9%，脂肪66%，碳水化合物25%)，6周后鹽酸小檗堿組加入200 mg/(kg·d)鹽酸小檗堿灌胃，均喂養(yǎng)24周，乙醚麻醉后斷頭處死，取肩胛部位的棕色脂肪組織保存于-80 ℃用于后續(xù)研究，每組取4只大鼠肩胛部位棕色脂肪組織用4%多聚甲醛固定、行常規(guī)HE染色。

1.2.2UCP-1 及PGC-1α mRNA表達(dá) (1)總RNA制備，取-80 ℃保存的棕色脂肪組織剪碎，加入TRIzol 1 mL充分勻漿，按QIAGEN試劑盒說明書介紹的方法提取總RNA，采用Nanodrop ND1000 測定RNA的濃度。(2)cDNA合成，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，每個反應(yīng)體系含RNA 1 μg、10×RT緩沖液2 μL、 dNTP 0.8 μL、隨機(jī)引物2 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，總反應(yīng)體系20 μL；反應(yīng)條件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，4 ℃后取出樣品，-20 ℃保存。(3)PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系10 μL，含cDNA模板2 μL、TaqMan?Master 5 μL、ddH2O 2.5 μL、引物0.5 μL(序列見表1)。PCR反應(yīng)條件95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 20 s，40個循環(huán)， 72 ℃ 5 min。每個qPCR重復(fù)3次，以GAPDH作為內(nèi)參照基因，目的基因的相對表達(dá)量通過公式2-ΔΔCt計(jì)算。

表1 Real-time PCR引物Tab.1 Real-time PCR primers

1.2.3UCP-1、PGC-1α蛋白表達(dá) (1)大鼠棕色脂肪組織總蛋白提取，取-80 ℃保存的大鼠棕色脂肪組織適量，加入RIPA裂解液1 mL，充分勻漿后提取總蛋白，通過BCA方法測量蛋白濃度。(2)檢測UCP-1、PGC-1α蛋白表達(dá)，將蛋白樣品40 μg加入10% SDS-PAGE點(diǎn)樣孔，100 V電壓電泳2 h，凝膠轉(zhuǎn)PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉，UCP-1、PGC-1α及β-actin一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加辣根過氧化物酶酶標(biāo)記的二抗常溫下30 min，TBST洗3次；化學(xué)發(fā)光法顯影、定影，將膠片進(jìn)行掃描拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠肩胛棕色脂肪組織HE染色

光鏡下可見對照組大鼠肩胛間棕色脂肪組織內(nèi)的細(xì)胞小而均勻，高脂喂養(yǎng)組大鼠棕色脂肪組織內(nèi)的細(xì)胞大小不一，結(jié)構(gòu)紊亂，鹽酸小檗堿組的棕色脂肪細(xì)胞排列較高脂喂養(yǎng)組整齊，細(xì)胞大小較均勻。見圖1。

2.2 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因表達(dá)

Real Time RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)組大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因表達(dá)水平顯著低于對照組，而鹽酸小檗堿組UCP-1、PGC-1α基因表達(dá)水平較高脂模型組明顯上調(diào)(P<0.05)。見圖2。

對照組 高脂喂養(yǎng)組 鹽酸小檗堿組圖1 各組大鼠肩胛棕色脂肪組織學(xué)(HE，×400)Fig.1 HE staining of scapula brown adipose tissue of rats each group under light microscope

注：1為對照組，2為高脂喂養(yǎng)組，3為鹽酸小檗堿組；(1)與對照組比較P<0.05，(2)與高脂喂養(yǎng)組比較P<0.05。圖2 大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因表達(dá)Fig.2 Expression of UCP-1 and PGC-1α genes in brown adipose tissue of scapula in rats

3 討論

肥胖的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織的功能與肥胖的發(fā)生密切相關(guān)。棕色脂肪組織由棕色脂肪細(xì)胞及血管構(gòu)成，含有豐富的線粒體，受交感神經(jīng)支配，既往認(rèn)為人類的棕色脂肪組織只存在新生兒階段，但新近研究發(fā)現(xiàn)在成年人中亦存在有功能的棕色脂肪組織[7]。棕色脂肪組織線粒體內(nèi)膜上UCP-1表達(dá)豐富，通過氧化脂肪酸產(chǎn)熱，在寒冷環(huán)境中維持體溫、或消耗機(jī)體攝取的過多能量，維持體內(nèi)能量代謝平衡[8-9]。PGC-1α是能量代謝途徑中眾多轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子，能誘導(dǎo)棕色脂肪組織中UCP-1的高表達(dá)[10]。本研究結(jié)果表明，高脂喂養(yǎng)的大鼠肩胛部位的棕色脂肪組織的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，細(xì)胞大小不一、排解紊亂，而且高脂喂養(yǎng)的大鼠肩胛部位的脂肪組織UCP-1、PGC-1αmRNA和UCP-1、PGC-1α蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，因此推測棕色脂肪組織的結(jié)構(gòu)及功能的改變與大鼠的肥胖發(fā)生相關(guān)。

有研究表明，UCP-1基因敲除小鼠易發(fā)生高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、并出現(xiàn)肥胖相關(guān)代謝紊亂如胰島素抵抗和高脂血癥[11]?，F(xiàn)代藥理研究表明小檗堿具有改善胰島素抵抗、糾正脂質(zhì)紊亂，促進(jìn)胰島素分泌等作用，認(rèn)為小檗堿可能通過調(diào)節(jié)類固醇結(jié)合元件結(jié)合蛋白、PPAR-γ等基因的轉(zhuǎn)錄從而改善糖尿病倉鼠的胰島素抵抗[12]，還有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能激活能量代謝感應(yīng)器AMPK，啟動脂肪酸氧化和糖酵解，改善胰島素抵抗[13]；亦有認(rèn)為UCP-1、PGC-1α基因的表達(dá)增加與能量消耗密切相關(guān)[14]。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)小檗堿對棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α基因的表達(dá)影響的相關(guān)報(bào)道，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿能改善高脂喂養(yǎng)大鼠肩胛棕色脂肪組織的結(jié)構(gòu)紊亂，推測這種改變可能與鹽酸小檗堿提高大鼠肩胛棕色脂肪組織UCP-1、PGC-1α的表達(dá)有關(guān)，但其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

綜上，鹽酸小檗堿具有抗炎，調(diào)節(jié)能量代謝，糾正脂代謝紊亂等多重作用，其通過影響肥胖大鼠棕色脂肪組織的結(jié)構(gòu)及功能改善肥胖大鼠的胰島素抵抗，為其在臨床中的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。