17β-雌二醇素對人三陰乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響*

張瑩， 金愛， 王旭東

(貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 生理學教研室， 貴州 貴陽 550004)

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)在各種乳腺癌亞型中具有較大的浸潤性，經常發(fā)生局部復發(fā)和器官轉移，是全世界女性最常見的惡性疾病之一[1]。17β-雌二醇素(17β-Estradiolum，E2)主要由卵巢分泌產生，是促進女性第二性征發(fā)育和性器官成熟的重要激素，能夠促進TNBC細胞的活性、增殖及轉移[2-3]。鈣激活中性蛋白酶(calcium-activated neutral protease，CANP或Calpain)是Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶水解家族，被某些特異性蛋白水解后可調節(jié)多種酶和蛋白質的生物學功能，并且在細胞增殖、信號轉導等方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。目前已有研究顯示，E2可通過CANP介導多種癌細胞的周期蛋白水解、增殖及遷移，也可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路介導CANP2影響TNBC的遷移及黏附[7]。Hippo信號通路首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，是由G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled estrogen receptor，GPER)和磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)調節(jié)[8]；Yes相關蛋白(yes-associated protein,YAP)是Hippo信號傳導途徑的主要下游因子，參與器官生長、組織修復，在多種惡性腫瘤中被廣泛激活，YAP過表達可以刺激腫瘤的發(fā)生和轉移，因此Hippo-YAP信號通路已被認為是腫瘤發(fā)生和轉移的重要因素[9-10]。另有研究顯示，干擾YAP基因的表達能有效抑制乳腺細胞的增殖并促進凋亡[11]，但CANP與YAP的相關性研究尚未見報道。因此，本研究通過細胞分子生物學手段，探討E2對TNBC細胞增殖和凋亡的生物學行為及CANP-YAP信號通路的介導作用，力圖為探尋TNBC的臨床有效治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1材料 人源乳腺癌細胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468分別購自中國科學院昆明細胞庫及中國科學院上海細胞庫。

1.1.2試劑 E2、鈣蛋白酶抑制劑(calpeptin，Cal)、鈣蛋白酶抑制劑Ⅲ(calpain Inhibitor Ⅲ，CI Ⅲ)、噻唑藍(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide ，MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司，YAP抗體購自美國CST公司，蛋白內參(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自中國巴傲德生物科技有限公司，羊抗小鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP購自美國Santa Cruz公司，全細胞裂解液(radio-immunoprecipitation asay，RIPA)、蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)及BCA蛋白定量試劑盒(bicinchoninic acid，BCA)購自中國碧云天生物技術有限公司，廣譜磷酸酶抑制劑混合物和廣譜蛋白酶抑制劑混合物購自中國博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) MDA-MB-231及MDA-MB-468細胞均采用含有10%血清和1%青霉素-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基，在25 cm2不透氣培養(yǎng)瓶于5% CO2的37 ℃恒溫無菌細胞培養(yǎng)箱中隔絕培養(yǎng)48 h。

1.2.2實驗分組 實驗分為4組，DMSO組加1‰ DMSO處理細胞，E2組用10 nmol/L E2處理細胞，E2聯(lián)合Cal組在用10 μmol/L Cal預處理細胞2 h后、再加入10 nmol/L E2處理細胞，E2聯(lián)合CI Ⅲ組在用10 μmol/L CI Ⅲ預處理細胞2 h后、再加入10 nmol/L E2處理細胞。

1.2.3MTT實驗 取所有細胞以每孔8 000個細胞密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，待48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，放回細胞培養(yǎng)箱孵育3 h，棄上清，每孔再加DMSO 150 μL，室溫下適當搖晃孵育20 min至甲臜完全溶解，采用酶標儀測定每個孔490 nm處的吸光度值。所有過程均避光操作。

1.2.4細胞平板克隆形成試驗 收集生長狀態(tài)良好的兩種細胞，按每孔200個細胞接種于6孔板中。按照實驗分組1.2.2加藥處理，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，培養(yǎng)板中有明顯細胞集落時停止培養(yǎng)；4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結晶紫水染色10 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗去非細胞染色，自然晾干后10倍物鏡下拍照計數(shù)，并計算克隆形成率[克隆形成率(%)=克隆數(shù)/200×100% ]。

1.2.5細胞凋亡試驗 用無乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的0.25%胰酶消化收集1.2.2項下加藥處理的細胞，用預冷的PBS洗滌3次，按照凱基Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明操作，加入重懸分散細胞500 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL充分混勻低溫靜置5 min，再加入碘化丙啶5 μL 震蕩混勻、避光孵育5～15 min，1 h內在倒置熒光顯微鏡下隨機取4個視野拍照記錄，并用Image J軟件檢測熒光強度。

1.2.6蛋白印跡(Western blot)檢測 所有細胞培養(yǎng)到細胞生長對數(shù)期時，加入新鮮配置的全細胞裂解液(RIPA ∶PMSF ∶磷酸酶抑制劑 ∶多種蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶1 ∶1)充分裂解細胞，置于冰上水平振搖20 min；用刮刀收取總蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度，以30 μg蛋白上樣，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)至溴酚藍條帶到玻板下緣1 cm處，在300 mA恒定電流下將分離蛋白轉至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%伊利脫脂奶粉室溫封閉2 h，按實驗要求稀釋抗體大腫瘤抑制基因(large tumor suppressor gene 1，LATS1)(1 ∶5 000)、YAP(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃搖晃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液(tris-buffered saline tween，TBST)每10 min洗膜3次，加入相應二抗(1 ∶4 000)室溫振搖孵育2 h，TBST洗膜3次，10 mi n/次；將化學發(fā)光試劑均勻滴加到PVDF膜上，Syngene Imaging系統(tǒng)進行成像，條帶灰度處理分析目的蛋白表達量[目的蛋白表達量=目的條帶的光密度(optical density，OD)/內參OD×100%]，實驗結果重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 E2對MDA-MB-231及468細胞增殖和凋亡的影響

MTT實驗結果顯示，E2組MDA-MB-231及468細胞的增殖率均顯著高于DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,或P<0.01)，見圖1A；細胞平板克隆形成試驗結果顯示，E2組MDA-MB-231及468細胞的菌落形成率均顯著高于DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1B、1C；細胞凋亡試驗結果顯示，E2組MDA-MB-231及468細胞熒光凋亡強度顯著低于DMSO組(P<0.05)，見圖1D。

注：A為MTT實驗，B為平板克隆實驗，C為平板克隆實驗的直條圖，D為熒光凋亡實驗； 與DMSO組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。圖1 E2對MDA-MB-231及468細胞增殖率和凋亡的影響Fig.1 Effect of E2 on proliferation and apoptosis of MDA-MB-23 and 468 cells

2.2 E2對MDA-MB-231及468細胞的YAP蛋白表達的影響

蛋白印跡檢測結果顯示，E2組MDA-MB-231、468細胞中YAP蛋白表達顯著高于DMSO組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。提示E2能上調MDA-MB-231和468細胞YAP表達。

注：(1)與DMSO組比較，P<0.05。 圖2 E2對MDA-MB-231及468細胞的YAP蛋白表達影響Fig.2 Effects of E2 on YAP protein expression in MDA-MB-231 and 468 cells

2.3 CANP抑制劑對E2誘導MDA-MB-231及468細胞增殖和增強抗凋亡能力的影響

MTT實驗結果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組MDA-MB-231、468細胞的增殖率均顯著低于E2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，或P<0.01)，見圖3A；細胞平板克隆形成試驗結果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組MDA-MB-231、468細胞的菌落形成率均顯著低于E2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3B、3C；細胞凋亡試驗結果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組MDA-MB-231、468細胞的熒光凋亡強度顯著高于E2組，見圖3D。

注：A為MTT實驗，B為平板克隆實驗，C為平板克隆實驗的直條圖，D為熒光凋亡實驗； 與E2組比較,(1)P <0.05，(2)P <0.01。圖3 CANP抑制劑對E2誘導MDA-MB-231及468細胞增殖和增強抗凋亡能力的影響Fig.3 Effects of CANP inhibitors on proliferation and anti-apoptotic ability of MDA-MB-231 and 468 cells induced by E2

CANP抑制劑對E2誘導MDA-MB-231及468細胞的YAP表達影響

Western blot結果顯示，E2聯(lián)合Cal組和E2聯(lián)合CI Ⅲ組中MDA-MB-231、468細胞YAP蛋白表達均顯著高于E2組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,或P<0.01)，見圖4。

注：與E2組比較，(1)P <0.05,(2)P <0.01。圖4 CANP抑制劑對E2誘導MDA-MB-231及468細胞YAP表達的影響(Western blot)Fig.4 Effects of CANP inhibitors on E2-induced YAP expression in MDA-MB-231 and 468 cells

3 討論

乳腺癌是世界范圍內影響女性生命健康的最常見疾病，也是女性癌癥患者死亡的主要原因，發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢[12]。目前該疾病已成為全球性問題，預計在未來幾年內發(fā)病率和死亡率會逐年增加，并有向年輕化發(fā)展的趨勢[13]。因此探討TNBC發(fā)病機制、尋找治療方法是目前全球學者都關注的問題。有證據(jù)表明，E2是導致乳腺癌惡性生長的重要原因，大多數(shù)人類乳腺癌初期均為雌激素依賴性[14]。雌激素受體(estrogen receptor，ER)核心蛋白在正常情況下受到嚴格調控，病理條件下表達缺失[15]。ER核因子或ER核外信號調節(jié)失控可促進ER陽性乳腺癌細胞的轉移[16]。有文獻報道，雌激素可通過GPER促進與腫瘤發(fā)生密切相關的Homeobox(HOX)轉錄本反義基因上調和誘導乳腺癌細胞遷移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231、468細胞中，E2刺激可明顯使上皮—間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關蛋白表達上調，并促進細胞活性增殖、遷移、侵襲。鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2在細胞中普遍表達，是細胞內非溶酶體細胞質需要鈣激活的半胱氨酸內肽酶[18]。CANP的內源特異性抑制劑是鈣蛋白酶抑制蛋白，具有惡性和良性組織中酶表達之間的差異[19]。Salehin等[18]研究表明，CANP信號通路參與介導包括HER2(+)或人乳腺腺癌細胞SKBR3和MDA-MB-231凋亡；也有報道稱，在MAPK信號的作用下CANP2具有影響細胞黏附與遷移的能力[20]。以上研究表明，在癌癥中CANP與腫瘤的許多惡性行為學相關。YAP是人類惡性腫瘤中普遍激活的高度相關的轉錄調節(jié)因子，最近的研究表明，YAP對于癌癥的發(fā)生或大多數(shù)實體瘤的生長是必需的，可活化誘導癌癥干細胞屬性、增殖、藥物抗性和轉移[21]。本研究結果表明，Cal和CI Ⅲ能明顯抑制E2對模型細胞增殖、抵抗細胞凋亡和細胞內YAP蛋白表達的影響，提示E2對TNBC細胞的惡性增殖及YAP蛋白表達的影響可能與CANP信號通路相關。

綜上所述，本研究結果表明，E2具有誘導模型細胞增殖、抵抗細胞凋亡的能力，Cal和CI Ⅲ可以阻斷E2誘導的上述生物學效應，提示E2可通過CANP-YAP信號通路促進腫瘤細胞的惡性生物學行為。