長鏈非編碼RNA ITGβ2-AS1對胰腺癌MAPK信號通路的作用及機制*

陳世裕，喻超，潘耀振，陳玲，李琳，楊哲豪，呂彥霖，鄧路，孫誠誼**

(1.貴州醫(yī)科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學 肝膽胰脾重點實驗室，貴州 貴陽 550004；4.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是惡性程度極高、進展迅速及預后極差的腫瘤，目前治療PC最有效的方式為早期手術切除[1-2]，但全球PC死亡率一直居高不下，5年生存率僅7%[3-4]。PC診斷及治療的困難與腫瘤細胞的增殖速度快和轉移能力強密切相關[5]，因此，尋找更為有效的治療方案成為當前PC研究的關鍵。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是長度>200 nt、但不具有編碼蛋白質功能的一類RNA[6-7]。研究認為LncRNA在腫瘤的侵襲及遷移過程中發(fā)揮重要的生物學功能[8-10]。LncRNA在各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中所起到的作用不斷被發(fā)現(xiàn)，有望成為臨床診療的新方向。Prensner等[11]發(fā)現(xiàn) LncRNA SChLAP1 在前列腺癌中表達上調，與患者生存呈負相關，其可能通過影響染色體重塑促進前列腺癌的侵襲及遷移。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是介導PC細胞增殖、侵襲及遷移功能的一條關鍵信號通路[12-14]，可被細胞因子及細胞黏附因子等激活，將信號轉導至胞內(nèi)最終轉錄調控相關靶基因的表達進而影響細胞功能[15-16]，研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可能在MAPK信號通路中發(fā)揮重要的生物學作用[17-18]。然而，LncRNA 整合素β2(ITGβ2)-AS1是否能調控MAPK信號通路下游相關靶基因以實現(xiàn)其功能仍不清楚，因此，在課題組前期研究的基礎上，本研究利用癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫分析ITGβ2-AS1可能發(fā)揮的細胞學功能和參與的信號通路、分析ITGβ2-AS1與人PC細胞株PANC-1細胞中MAPK信號通路的調控關系，以進一步闡明其在PC的增殖、侵襲及遷移過程中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人PC細胞株PANC-1細胞株為中山大學腫瘤防治中心惠贈，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(TRYPSIN)、DMEM及RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國gibco公司，RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，BCL2、MMP9及MYC等引物購自Sangon Biotech公司，相應Western blot一抗購自proteintech公司，ITGβ2-AS1-sh購自RIBOBIO公司，逆轉錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 利用cBioPortal網(wǎng)站在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org/)，選擇胰腺導管腺癌數(shù)據(jù)庫PAAD，數(shù)據(jù)類型選擇mRNA表達譜，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果，選取與ITGβ2-AS1相關的基因中相關系數(shù)較大(Person系數(shù)>0.6)的基因進行GO富集分析，包括細胞組成(cellular component,CC)、生物過程(biological process,BP)及分子功能(molecular function,MF)分析。

1.2.2細胞培養(yǎng) 人PC細胞株PANC-1使用含10%FBS及1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、含5% CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，分為ITGβ2-AS1干擾對照組(Negative Control組)及ITGβ2-AS1干擾組(ITGβ2-AS1-sh組)。

1.2.3mRNA表達 選擇處于對數(shù)生長期的PANC-1細胞，提取其總RNA，分別測量A260/A280時的吸光度，選取吸光度值在1.8～2.0的樣品進行實驗。依照逆轉錄試劑盒的說明，分別將樣品逆轉錄為cDNA，再選擇GAPDH作為內(nèi)參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進行qPCR實驗。

1.2.4蛋白表達 選擇處于對數(shù)生長期的PANC-1細胞，提取其總蛋白，根據(jù)蛋白定量結果點樣、電泳、轉膜、封閉、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、曝光，用Image Lab軟件分析所得條帶的灰度值，檢測各相關指標的蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 ITGβ2-AS1的生物學功能

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果，選取與ITGβ2-AS1相關的基因中相關系數(shù)較大(Person系數(shù)>0.6)的基因進行GO富集分析。CC分析結果顯示：ITGβ2-AS1可能負調控細胞凋亡過程，正調控GTP酶活性和各信號通路轉導MAPK信號通路(圖1A)； BP分析結果顯示ITGβ2-AS1可能存在于細胞膜外區(qū)域、外泌體及高爾基體膜區(qū)域(圖1B)， MF分析結果顯示ITGβ2-AS1可能與氧轉運體活性、離子通道結合及RAS活性調控等功能相關(圖1C)，提示ITGβ2-AS1可能與PC的增殖及相關腫瘤信號通路轉導密切相關。

圖1 GO富集分析ITGβ2-AS1的生物學功能Fig.1 GO enrichment analysis of the biological function of ITGβ2-AS1

2.2 ITGβ2-AS1的下游信號通路

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果，選取與ITGβ2-AS1相關的信號通路中相關系數(shù)位于前12的信號通路進行分析，結果顯示：多條信號通路與PC的發(fā)生發(fā)展過程顯著相關，如癌癥信號通路(Pathways in cancer)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)及缺氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等(圖2)；提示ITGβ2-AS1可能參與多條癌癥信號通路如MAPK信號通路的轉導與調控。

圖2 生物信息學分析ITGβ2-AS1的下游信號通路Fig.2 KEGG analysis of ITGβ2-AS1-associated signaling pathway

2.3 對MAPK信號通路靶基因表達的影響

生物信息學分析結果顯示：ITGβ2-AS1可能與MAPK信號通路靶基因BCL2、MMP9及MYC的表達顯著相關且存在共表達的關系(圖3A)；qPCR結果(圖3B)表明與干擾對照組比較，ITGβ2-AS1干擾組PANC-1細胞BCL2、MMP9及MYCmRNA表達水平顯著下調(P<0.05)；這些結果提示ITGβ2-AS1可能正調控MAPK信號通路靶基因的表達。

注：(1)與Negative Control組比較，P<0.05。圖3 ITGβ2-AS1對MAPK信號通路靶基因表達的影響Fig.3 Effect of ITGβ2-AS1 on the expression of target genes of MAPK signaling pathway

2.4 ITGβ2-AS1對MAPK信號通路活性的影響

如圖4所示，ITGβ2-AS1干擾組PANC-1細胞總ERK1/2蛋白表達水平與干擾對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而磷酸化的ERK1/2蛋白表達水平則顯著低于干擾組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示ITGβ2-AS1可能通過調控ERK1/2的磷酸化水平從而影響MAPK信號通路的活性。

注：(1)與Negative Control組比較，P<0.05。圖4 ITGβ2-AS1對MAPK信號通路活性的影響(Western blot)Fig.4 Effect of ITGβ2-AS1 on the activity of MAPK signaling pathway

3 討論

PC由于其發(fā)病過程隱匿、進展迅速、早期診斷及手術切除困難導致治療效果不佳。近年來，盡管各種治療方法不斷完善，但PC患者的 5 年生存率仍低于7%，其重要原因之一就是其侵襲能力極強[4-5]。

整合素蛋白家族 (integrin family,ITG) 是廣泛分布于細胞表面的四類細胞黏附分子之一，是由α和β兩個亞基組成的異源二聚體跨膜蛋白整合素家族，可以改變腫瘤的增殖、侵襲及遷移等多種生物學功能[19-20]。其中，ITGβ2主要在各種白細胞的表面表達，并能夠與腫瘤細胞表面的黏附分子結合，從而賦予腫瘤細胞向遠處轉移的能力[21-22]。有研究報道，長鏈非編碼RNA ITGβ2-AS1起源于ITGβ2的啟動子，LncRNA ITGβ2-AS1通過上調ITGβ2的表達從而促進乳腺癌的侵襲和遷移[23],并在骨肉瘤的增殖和轉移過程中發(fā)揮著重要作用[24]。LncRNA的表達失常與包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]。然而，對于 LncRNA 在腫瘤中所起到的作用目前尚處于初步探索階段，特別是對LncRNA ITGβ2-AS1在PC的侵襲轉移過程中所發(fā)揮的作用更是知之甚少，因此，進一步深入研究其發(fā)揮作用的分子機制有助于為臨床提供更為有效的治療措施。

細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)是MAPK信號通路的重要成員之一，是將信號從細胞表面受體傳導至細胞核的關鍵，參與細胞的增殖、分化、凋亡和癌變等多種生物學反應[25-26]，其因在激活的生長因子受體與基因表達的變化中的作用最為人們所熟知，激活的ERK1/2進入細胞核并磷酸化轉錄因子；ERK1/2也可轉移到內(nèi)質網(wǎng)、核小體及高爾基體和線粒體等其他細胞器激活特定的底物從而影響細胞的生理過程[27-28]。然而，目前對于LncRNA在PC細胞ERK1/2的磷酸化激活過程中的調控方式仍不完全清楚。本研究先通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)ITGβ2-AS1可能與PC的增殖及相關腫瘤信號通路轉導密切相關，并可能參與下游MAPK信號通路的轉導與調控；通過相關性分析及qPCR實驗驗證，結果顯示ITGβ2-AS1可顯著調控MAPK信號通路中與PC細胞增殖、侵襲及異常代謝顯著相關的靶基因BCL2、MMP9及MYC的表達，推斷ITGβ2-AS1可能激活MAPK信號通路進而調控下游的靶基因。最后通過Western blot實驗驗證上述推斷，結果提示ITGβ2-AS1可顯著影響ERK1/2的磷酸化水平，從而發(fā)揮調節(jié)MAPK信號通路的作用。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析并結合相關實驗驗證，ITGβ2-AS1在PC細胞相關腫瘤信號通路——MAPK信號通路的激活過程中發(fā)揮重要作用，ITGβ2-AS1通過調控MAPK信號通路中關鍵分子ERK1/2的磷酸化水平，進而調控下游靶基因的表達。課題組今后將進一步通過相關分子生物學實驗及臨床樣本信息深入探討ITGβ2-AS1介導MAPK信號通路激活在PC的發(fā)生發(fā)展過程中的具體分子機制及臨床意義，為發(fā)現(xiàn)可能針對PC治療的新靶點提供理論依據(jù)。