1-氯-3-丁烯-2-醇的細(xì)胞遺傳毒性

李玉峰,劉欣杰,張新宇

(上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染與健康研究所, 上海200444)

1,3-丁二烯(簡稱丁二烯)是一種石油化工產(chǎn)品, 主要用于制造合成橡膠、樹脂和塑料. 它是一種無色氣體, 也是一種空氣污染物, 在環(huán)境中的主要來源是化石燃料和生物質(zhì)的不完全燃燒, 如汽車尾氣和香煙煙霧等[1]. 因此, 丁二烯廣泛存在于城市空氣中, 其濃度范圍通常為(0.1 ～1.0)×10-9[1].

丁二烯是一種已確定的人類致癌物(IARC Group 1), 可在暴露人體上誘發(fā)淋巴-造血系統(tǒng)癌癥[1]. 丁二烯致癌風(fēng)險很高，0.014×10-9濃度丁二烯的致癌風(fēng)險水平達(dá)到了10-6[2], 而苯需要(0.04 ～0.14)×10-9濃度才能達(dá)到同樣的風(fēng)險水平[3]. 已有多項(xiàng)研究表明, 丁二烯是具有最高致癌風(fēng)險的環(huán)境污染物之一[4-7], 也是香煙煙霧中致癌性最強(qiáng)的化合物[8], 即使在二手煙和三手煙中也是最有害的揮發(fā)性有機(jī)化合物之一[9].

代謝是丁二烯致癌的根本原因. 丁二烯進(jìn)入生物體內(nèi)后可通過兩條途徑代謝, 產(chǎn)生多種具有致突變性的產(chǎn)物. 這兩條途徑分別稱為P450 途徑和MPO(myeloperoxidase, 髓過氧化酶)途徑(見圖1)[10]. 在P450 途徑中, 丁二烯在肝臟、腎臟和肺臟等器官中被P450 酶代謝為3,4-環(huán)氧-1-丁烯(3,4-epoxy-1-butene, EB)、1,2,3,4-雙環(huán)氧丁烷(1,2,3,4-diepoxybutane, DEB)和3,4-環(huán)氧-1,2-丁二醇(3,4-epoxy-1,2-butanediol, EBD)[1]. 在MPO 途徑中, 丁二烯在骨髓和血液白細(xì)胞中被MPO 代謝為1-氯-3-丁烯-2-醇(1-chloro-2-hydroxy-3-butene, CHB)[10-11]. 上述4 種產(chǎn)物已被證明具有致突變性. 由于丁二烯在人體內(nèi)致癌作用的靶器官是淋巴-造血系統(tǒng)[1-2], 而骨髓是此系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分, 這提示MPO 途徑可能與丁二烯的致癌作用密切相關(guān)[10]. 因此, 作為這條途徑上的產(chǎn)物, CHB 可能在丁二烯致癌作用中起關(guān)鍵作用, 值得深入研究.

圖1 丁二烯的代謝途徑和主要代謝產(chǎn)物Fig.1 Metabolic pathways and major metabolites of 1,3-butadiene

由圖1 可知, CHB 可以在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)作用下進(jìn)一步代謝為1-氯-3-丁烯-2-酮(1-chloro-3-buten-2-one, CBO)[12]. CBO 是一種強(qiáng)的Michael 受體,其分子兩端均可與親核試劑反應(yīng), 因此具有交聯(lián)能力. 研究發(fā)現(xiàn): CBO 很容易與谷胱甘肽(glutathione,GSH)反應(yīng)生成單/雙偶聯(lián)產(chǎn)物, 也容易與蛋白質(zhì)反應(yīng)并引起蛋白質(zhì)交聯(lián)[12], 或者與核酸堿基及DNA 反應(yīng)產(chǎn)生多種DNA 加合物[13-16]. CHB 和CBO 均有細(xì)胞毒性和遺傳毒性, 且CBO的毒性比CHB 強(qiáng)約100 倍, 但二者的遺傳毒性特征并不完全相同: CHB 會產(chǎn)生兩種類型的DNA 損傷, 即DNA 單鏈斷裂和堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)(alkali-labile sites, ALS), 但CBO 只產(chǎn)生ALS 損傷, 且CHB 還具有致突變性[17].

然而, 上述研究只是發(fā)現(xiàn)了CHB 具有遺傳毒性(即能夠引起DNA 損傷), 以及能夠引起兩種類型的DNA 損傷, 但CHB 引起DNA 損傷的途徑還不清楚. 有一種推測是CHB 的毒性可能是其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為CBO 導(dǎo)致的, 因?yàn)镃BO 毒性比CHB 強(qiáng)得多, 只要很少量CHB 被轉(zhuǎn)化為CBO 就足以引起顯著的毒性. 因此, 本工作對此進(jìn)行了進(jìn)一步研究, 發(fā)現(xiàn)CHB 毒性主要還是由其自身的反應(yīng)性引起的, 而并非是由其在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為CBO 引起的.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司. 4-甲基吡唑(4-methylpyrazole,4-MP)和1-卞基咪唑(1-benzylimidazole,BI)購于Sigma-Aldrich. 3-丁烯-2-醇(3-buten-2-ol, BO)購于Alfa Aesar. DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養(yǎng)基、IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購于Life Technologies. 青霉素和鏈霉素購于北京鼎國生物科技有限公司. 人胚肝L02 細(xì)胞株和人白血病HL-60 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫. CHB 和CBO 按照文獻(xiàn)[12]方法合成.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

L02 細(xì)胞在含10% FBS, 100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中, 在含有5% CO2的37?C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 待細(xì)胞處于對數(shù)生長期, 生長至70%～80%時進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn). HL-60 細(xì)胞在含20% FBS, 100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的IMDM 培養(yǎng)基中, 在含有5% CO2的37?C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 待細(xì)胞處于對數(shù)生長期, 即細(xì)胞傳代后的24 h 之內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 化合物遺傳毒性檢測的一般程序

除去細(xì)胞上的培養(yǎng)液(HL-60 細(xì)胞為懸浮細(xì)胞, 故需通過離心沉淀細(xì)胞后, 再除去上清液).待測化合物溶于DMSO 制成0.5 或1 mol/L 溶液, 以0.1%體積加入到無血清培養(yǎng)基中(當(dāng)需要長時間(≥12 h)處理細(xì)胞時, 使用含有血清的培養(yǎng)基), 混合均勻后添加到細(xì)胞上. 在含有5% CO2的37?C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h 后, 用標(biāo)準(zhǔn)彗星實(shí)驗(yàn)(the Comet assay)檢測DNA 損傷情況[18]. 陰性對照組細(xì)胞用含0.1%體積DMSO 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h.

彗星實(shí)驗(yàn), 又稱單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis, SCGE)分析, 是目前使用最廣泛的一種檢測真核細(xì)胞DNA 損傷的方法. 標(biāo)準(zhǔn)彗星實(shí)驗(yàn)在強(qiáng)堿性(pH ＞13)條件下進(jìn)行,可檢測DNA 的鏈斷裂、堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)(即失去堿基的位點(diǎn))以及DNA-DNA/DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián). 其基本原理是將細(xì)胞以單個狀態(tài)固定在瓊脂糖凝膠中, 經(jīng)過裂解并去除組蛋白后, 只剩下裸露的DNA 留在瓊脂糖中, 再施以適當(dāng)?shù)闹绷麟妶鲞M(jìn)行電泳, 損傷的DNA 向陽極遷移而形成拖尾. 拖尾程度與DNA 損傷呈正相關(guān)關(guān)系, 因而可以以拖尾程度定量衡量DNA 受損程度. 由于電泳后觀察到的DNA 狀態(tài)(通過熒光染料染色)具有一個明亮的圓形頭部, 帶有一條較暗的尾部, 形似彗星, 故得名彗星實(shí)驗(yàn).

1.4 含有CHB 的培養(yǎng)基溶液放置不同時間后遺傳毒性的變化情況

按照1.3 節(jié)中的程序制備含有500 μmol/L CHB 的無血清培養(yǎng)基溶液, 在37?C 培養(yǎng)箱中分別放置0.5, 1, 4和18 h, 然后添加到L02 細(xì)胞上, 培養(yǎng)1 h, 用彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測.

1.5 CHB 引起的DNA 損傷隨著不同細(xì)胞處理時間的變化

按照1.3 節(jié)中的程序制備含有1 000 μmol/L CHB 的培養(yǎng)基溶液, 添加到L02 細(xì)胞上, 分別在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5, 1, 2, 4 和12 h, 用彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測.

1.6 P450 酶和ADH 抑制劑對CHB 遺傳毒性的影響

L02 和HL-60 細(xì)胞用含1 000 μmol/L BI 和1 000 μmol/L 4-MP 的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h, 然后用1 000 μmol/L CHB 培養(yǎng)1 h, 用彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測.

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置至少3 個平行樣(平行樣具體數(shù)目見圖標(biāo)中的說明), 取平行樣的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差. 實(shí)驗(yàn)組與對照組數(shù)據(jù)的比較使用Student’s t-test, 以0.05 作為統(tǒng)計顯著性的臨界值.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BO 的遺傳毒性

CHB 具有遺傳毒性. 從化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度分析, 這可能應(yīng)歸因于CHB 分子中的氯甲基. 因?yàn)槁燃谆拇嬖趯?dǎo)致CHB 具有親電性, 可能與DNA 或蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生毒性. 為驗(yàn)證這一點(diǎn), 本工作檢測了3-丁烯-2-醇(3-buten-2-ol, BO)的遺傳毒性. BO 與CHB 在結(jié)構(gòu)上的唯一差別就是BO 分子中沒有氯原子.

結(jié)果表明, 500 和1 000 μmol/L BO 在細(xì)胞上沒有引起任何DNA 損傷, 而在同樣條件下,1 000 μmol/L CHB 產(chǎn)生的DNA 損傷達(dá)20.4% ± 3.0%(陰性對照組為7.4%±2.3%, 見圖2).因此可知, 氯甲基是CHB 遺傳毒性中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素.

圖2 500 和1 000μmol/L BO 與1 000μmol/L CHB 引起的DNA 損傷對比(5 個平行樣,***p ＜0.001)Fig.2 DNA damage caused by 500, 1 000 μmol/L BO, and 1 000 μmol/L CHB (quintuplicate,***p ＜0.001)

2.2 含有CHB 的培養(yǎng)基溶液放置后遺傳毒性增強(qiáng)

CHB 分子中的氯甲基使得CHB 具有反應(yīng)性, 不僅可能與生物分子發(fā)生反應(yīng), 而且還可能在溶液中發(fā)生水解等反應(yīng), 從而轉(zhuǎn)化為其他毒性化合物. 這也可能是CHB 具有遺傳毒性的原因之一. 為檢驗(yàn)這種推測, 將含有500 μmol/L CHB 的無血清培養(yǎng)基在37?C 放置0.5, 1, 4 和18 h, 然后檢查培養(yǎng)基的毒性, 結(jié)果如圖3 所示.

含有CHB 的培養(yǎng)基溶液放置后毒性發(fā)生了改變. 與未放置的溶液(圖3 中0 h 的數(shù)據(jù))相比, 放置0.5 和1 h 后的毒性實(shí)際上沒有發(fā)生變化(p ＞0.05). 然而, 放置4 和18 h 后的溶液毒性明顯增強(qiáng), 且差異具有統(tǒng)計顯著性(*p ＜0.05, **p ＜0.01). 這說明CHB 在溶液中會轉(zhuǎn)化為其他毒性更強(qiáng)的化合物, 但此轉(zhuǎn)化過程較慢, 在1 h 內(nèi)的轉(zhuǎn)化可忽略.

2.3 CHB 引起的DNA 損傷隨著細(xì)胞處理時間的變化

為觀察CHB 引起的DNA 損傷隨細(xì)胞處理時間的變化趨勢并與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比,用1 000 μmol/L CHB 分別處理細(xì)胞0.5, 1, 2, 4 和12 h, 然后檢查DNA 損傷情況, 結(jié)果如圖4 所示.

圖3 含有500 μmol/L CHB 的無血清培養(yǎng)基溶液在37 ?C 放置不同時間后的遺傳毒性(3 個平行樣,*p ＜0.05, **p ＜0.01)Fig.3 Genotoxicity of 500 μmol/L CHB in FBS-free media after incubation at 37 ?C for specified time (triplicate, *p ＜0.05, **p ＜0.01)

圖4 1 000 μmol/L CHB 引起的DNA 損傷隨細(xì)胞處理時間不同的變化情況(4 個平行樣, **p ＜0.01,***p ＜0.001)Fig.4 DNA damage caused by 1 000 μmol/L CHB at different cell-incubation time (tetraplicate,**p ＜0.01, ***p ＜0.001)

結(jié)果表明, 在4 h 內(nèi), CHB 引起的DNA 損傷隨細(xì)胞處理時間的增加而增大. 與陰性對照組(4.6% ± 1.6%, 圖中未顯示)相比, 細(xì)胞用CHB 處理0.5 h 即產(chǎn)生了相當(dāng)強(qiáng)的損傷(14.0%±3.7%, **p ＜0.01); 處理1 h 后損傷繼續(xù)增大, 但與0.5 h 的結(jié)果相比, 差異不具有統(tǒng)計顯著性. 然而, 處理2 和4 h 后產(chǎn)生的DNA 損傷與處理0.5 h 的相比, 差異具有統(tǒng)計顯著性(**p ＜0.01, ***p ＜0.001). 另一方面, 過長的處理時間(12 h)反而會導(dǎo)致DNA 損傷的減小(但此時的損傷仍然明顯高于0.5 h 的損傷, **p ＜0.01), 這可能是由于DNA 修復(fù)的緣故.

2.4 CHB 對DNA 的損傷機(jī)理

由于CHB 可被ADH 代謝為CBO, 而CBO 的毒性約為CHB 的100 倍, 因此只要1%的CHB 在細(xì)胞內(nèi)被代謝為CBO, 就能產(chǎn)生觀察到的CHB 毒性結(jié)果. 為檢驗(yàn)這種可能性, 使用ADH 抑制劑4-MP 進(jìn)行實(shí)驗(yàn). 考慮到CHB 還可能被P450 酶代謝為CBO, 故也使用了P450廣譜抑制劑BI. 此實(shí)驗(yàn)在L02 和HL-60 兩種細(xì)胞株上進(jìn)行.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 在兩種細(xì)胞株中, 加入抑制劑4-MP 和BI 后對于CHB 引起的DNA 損傷沒有影響(圖略), 表明CHB 的遺傳毒性不是通過轉(zhuǎn)化為CBO 產(chǎn)生的.

3 討 論

CHB 可能是1,3-丁二烯對人體產(chǎn)生致癌效應(yīng)的一種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物, 因此對它的研究非常重要. 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CHB 能夠損傷DNA, 引起DNA 單鏈斷裂和ALS. 本工作的研究目的是希望闡明CHB 是通過什么途徑損傷DNA 的.

一種化合物可通過直接和間接途徑損傷DNA. 直接途徑就是化合物直接與DNA 發(fā)生反應(yīng), 形成DNA 加合物或引起DNA 脫堿基(即形成ALS)或DNA 斷裂. 間接途徑則較為復(fù)雜,包括: ①轉(zhuǎn)化為其他能直接與DNA 發(fā)生反應(yīng)的化合物, 這種轉(zhuǎn)化可以是化學(xué)轉(zhuǎn)化(即通過簡單化學(xué)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化, 如水解等), 也可以是生物轉(zhuǎn)化(即在酶的作用下進(jìn)行的轉(zhuǎn)化); ②其他細(xì)胞機(jī)理(主要是氧化應(yīng)激).

沒有氯原子的對應(yīng)化合物BO 即使在相當(dāng)高的濃度(1 000 μmol/L)下都沒有表現(xiàn)出任何遺傳毒性, 而同樣條件下的CHB 則產(chǎn)生了強(qiáng)毒性(見圖2). 這說明氯甲基的存在是CHB 毒性產(chǎn)生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素. 從化學(xué)反應(yīng)性來看就容易解釋了. 因?yàn)槁燃谆怯H電性的, 且氯甲基相鄰碳原子上有一個羥基, 其吸電子能力進(jìn)一步增強(qiáng)了氯甲基的親電性, 故氯甲基能與DNA 堿基中的氮原子發(fā)生親核取代反應(yīng), 從而損傷DNA. 因此, 就化學(xué)反應(yīng)性而言, CHB 是能夠通過直接途徑損傷DNA 的.

含有CHB 的培養(yǎng)基溶液放置后出現(xiàn)了遺傳毒性增加的現(xiàn)象(見圖3), 表明CHB 能發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化, 且轉(zhuǎn)化形成的化合物毒性更強(qiáng). 這可能也是氯甲基反應(yīng)性引起的結(jié)果. 因?yàn)樗肿又械难踉踊駽HB 自身的羥基氧原子能與氯甲基發(fā)生親核取代反應(yīng), 即發(fā)生CHB 的水解或分子內(nèi)的環(huán)合, 產(chǎn)生3-丁烯-1,2-二醇(3-buten-1,2-diol, BDD)或EB(見圖5). BDD 毒性很弱而EB 毒性較強(qiáng)[19], 故CHB 的化學(xué)轉(zhuǎn)化可能主要產(chǎn)生EB.

圖5 在溶液中CHB 可能轉(zhuǎn)化為EB 和BDDFig.5 CHB may be converted to EB and BDD in solution

然而, CHB 化學(xué)轉(zhuǎn)化過程較慢. 與未經(jīng)放置的含有CHB 的培養(yǎng)基溶液相比, 放置0.5 和1 h 的溶液毒性實(shí)際上沒有變化(見圖3). 與此形成鮮明對照的是, 直接用CHB 溶液處理細(xì)胞時, 即使處理時間只有0.5 h, 產(chǎn)生的DNA 損傷已經(jīng)相當(dāng)強(qiáng)(見圖4). 顯然, 這說明CHB 的毒性是由其自身引起的, 而不是化學(xué)轉(zhuǎn)化為其他化合物的結(jié)果. 當(dāng)然, 如果CHB 處理細(xì)胞的時間較長(≥4 h), 則不排除化學(xué)轉(zhuǎn)化對CHB 表現(xiàn)出來的毒性有一定貢獻(xiàn)的可能(見圖3 和4). 必須指出, 這種情況(即長時間處理細(xì)胞)較為復(fù)雜, 毒性可能產(chǎn)生累積效應(yīng), 故化學(xué)轉(zhuǎn)化對CHB毒性的貢獻(xiàn)只是一種推測, 證據(jù)尚不充分.

使用P450 酶和ADH 抑制劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, CHB 的毒性并非由于其生物轉(zhuǎn)化為CBO產(chǎn)生. 實(shí)際上, 已有文獻(xiàn)報道培養(yǎng)的肝細(xì)胞內(nèi)沒有P450 和ADH 等代謝酶的表達(dá)[20]. 因此,CHB 在L02 細(xì)胞中引起DNA 損傷這一事實(shí)本身已經(jīng)說明其毒性并非轉(zhuǎn)化為CBO 的結(jié)果.

最后, CHB 的毒性也不大可能是由其他細(xì)胞機(jī)理引起的. 本工作對CHB 是否引起氧化應(yīng)激進(jìn)行了初步檢測. 結(jié)果表明, CHB 在L02 細(xì)胞中沒有引起明顯的氧化應(yīng)激.

綜上所述, 本研究結(jié)果說明, CHB 可能主要通過直接途徑(即直接與DNA 發(fā)生反應(yīng))而不是通過轉(zhuǎn)化為CBO 損傷DNA. 但在長時間(≥4 h)處理細(xì)胞的情況下, 化學(xué)轉(zhuǎn)化為其他毒性化合物可能對CHB 的毒性產(chǎn)生也有一定貢獻(xiàn).

4 結(jié)束語

本工作對CHB 產(chǎn)生遺傳毒性的原因進(jìn)行了研究, 發(fā)現(xiàn)CHB 主要通過直接途經(jīng)引起DNA損傷. 這可能歸因于CHB 的親電反應(yīng)性. 研究結(jié)果對于深入理解CHB 的毒性和致突變性提供了重要的基礎(chǔ).