上海春季大氣顆粒物中致敏懸鈴木花粉蛋白的分布特征

趙 慧, 彭加仙, 洪 強(qiáng), 張紅莉, 王偉倩, 王青躍,譚正瑩, 周樹敏, 張 衛(wèi), 呂森林

(1. 上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院, 上海200444; 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海200444;3. 日本埼玉大學(xué)大學(xué)院理工學(xué)研究科, 埼玉338-8570)

近年來(lái), 隨著城市綠化面積的增加和植物種類的增多, 人群中花粉過(guò)敏的就診率也在逐年遞增. 花粉癥的發(fā)病率升高, 已成為全球性的問(wèn)題. 在國(guó)內(nèi), 花粉癥患者在人群中的發(fā)病率約為0.5%～1.0%, 最高的發(fā)病地區(qū)可達(dá)5%[1]. 研究表明, 花粉是誘發(fā)季節(jié)性過(guò)敏性鼻炎和哮喘的主要原因[2]. 在外部因素的作用下, 花粉內(nèi)部的細(xì)顆粒物(subpollen particles, SPPs)會(huì)被釋放出來(lái)[3], 長(zhǎng)期懸浮在環(huán)境中, 成為PM2.5的一部分, 對(duì)人群健康產(chǎn)生影響. 資料顯示, 懸鈴木屬植物花粉是我國(guó)主要的致敏花粉[4], 其致敏蛋白主要包括Pla a1, Pla a2 和Pla a3, 其中Pla a3 屬于非特異性的糖蛋白脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白[5-7]. 作為城市道路景觀樹, 懸鈴木在上海市分布廣泛, 其花粉已經(jīng)成為上海市春季主要的致敏原[8-9]. 本工作選擇上海大氣顆粒物中致敏懸鈴木花粉蛋白Pla a3 為研究對(duì)象, 利用生物工程手段表達(dá)Pla a3 蛋白, 并使用該致敏蛋白免疫大鼠, 獲取單一致敏原的抗體, 利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 檢測(cè)分析上海市大氣顆粒物中Pla a3 蛋白的分布特征. 這一研究工作不僅可以為今后進(jìn)一步制備單抗及基因工程生產(chǎn)花粉變應(yīng)原奠定基礎(chǔ), 提高過(guò)敏性哮喘病的診治水平, 還可以為上海城鎮(zhèn)綠化植物的合理選擇和配置提供重要的參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 大氣顆粒物采集

本工作采集了上海2017 年春季的大氣顆粒物, 使用日本柴田公司SIBATA 五級(jí)大流量采樣器采集大氣顆粒物. 采集前, 將石英膜在馬弗爐(450?C)中焙燒4 h, 在恒溫恒濕箱中以25?C 溫度和50%濕度條件放置24 h, 用電子天平準(zhǔn)確稱重, 然后用干凈的鋁箔紙包裹, 放置在-4?C 的冰箱中保存[10]. 采樣地點(diǎn)在上海大學(xué)寶山校區(qū)南門, 采樣高度為1.5 m, 每次采樣周期為48 h. 采樣器能將大氣中的顆粒物根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)直徑分別采集到5 張石英濾膜上, 工作流速為566 L/min, 五級(jí)的切割粒徑分別為＞7.0, 3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0, ＜1.1μm. 采樣結(jié)束后, 濾膜用鋁箔紙包裹好, 恒溫恒濕24 h 后稱重, 然后密封包裝于-20?C 的冰箱中冷凍保存, 以待分析測(cè)試.

1.2 抗體制備

克隆懸鈴木花粉變應(yīng)原蛋白Pla a3 的編碼序列(coding sequence, CDS), 構(gòu)建到原核表達(dá)載體Pet-32a 中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta 菌株, 在28?C 條件下經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白, 并進(jìn)行純化. 利用純化后的Pla a3 重組蛋白免疫注射SD 大鼠, 然后利用懸鈴木花粉浸取液混合Pla a3 重組蛋白對(duì)大鼠進(jìn)行霧化處理[11-12]. 最后, 獲取致敏大鼠血清并對(duì)其中所含抗體的特異性及其效價(jià)進(jìn)行鑒定. 鑒定結(jié)果顯示, 本工作獲得了特異性良好、高效價(jià)的IgE 抗體, 可用于后續(xù)檢測(cè)分析上海大氣顆粒物中懸鈴木花粉致敏蛋白Pla a3 的分布特征.

1.3 總蛋白測(cè)定

本工作采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型, 上海翊圣生物科技有限公司, 中國(guó))測(cè)定大氣顆粒物中的總蛋白質(zhì)量濃度. 二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid, BCA)是目前應(yīng)用比較廣泛的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法. 基于雙縮脲反應(yīng), 即在堿性條件下蛋白質(zhì)將Cu2-還原成Cu-, 產(chǎn)生一種紫藍(lán)色復(fù)合物, 在562 nm 處有高的吸光值. 該反應(yīng)物的量與蛋白質(zhì)濃度成正比. 具體操作步驟如下.

步驟1 預(yù)處理: 取1/8 采集顆粒物的濾膜, 用6 mL 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)浸 泡6 h; 將 所 得 溶 液 在4?C, 5 000 r/min 條 件 下 離 心20 min, 然后經(jīng)0.45μm 過(guò)濾器過(guò)濾[13]后;再用真空濃縮儀(Eppendorf AG,德國(guó))濃縮濾液到2 mL,-20?C 保存?zhèn)溆?

步驟2 比色皿檢測(cè): 各取0.1 mL 標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入反應(yīng)管中, 每管加入2.0 mL BCA 工作液, 混勻, 37?C 孵育30 min.

步驟3 冷卻至室溫, 在分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè). 設(shè)定波長(zhǎng)為562 nm, 在10 min 內(nèi)對(duì)所有樣品讀數(shù).

1.4 ELISA

ELISA 是指利用抗原與抗體的特異反應(yīng), 將待測(cè)物與酶連接, 然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng), 用于抗原與抗體結(jié)合狀況的定量測(cè)定. 具體操作步驟如下.

步驟1 預(yù)處理: 取1/8 采集顆粒物的濾膜, 用6 mL 的PBS 緩沖液浸泡6 h; 將所得溶液在4?C, 5 000 r/min 條件下離心20 min, 然后經(jīng)0.45μm 過(guò)濾器過(guò)濾后; 再用真空濃縮儀濃縮濾液到2 mL, -20?C 保存?zhèn)溆?

步驟2 包被: 取96 微孔板, 每個(gè)反應(yīng)孔中加100 μL 待測(cè)樣品濃縮液(重復(fù)3 個(gè)孔),4?C 避光孵育16 h, 以空白膜提取液為空白對(duì)照. 孵育結(jié)束后用PBST 洗滌液(加入0.5%Tween-20 的PBS 溶液)沖洗3 次, 每次5 min.

步驟3 封閉: 每孔加5%的脫脂奶粉溶液, 注滿后37?C 靜置1.5 h 后洗滌, 洗滌條件同步驟2.

步驟4 孵育一抗: 加100μL 大鼠血清(1∶50), 37?C 避光孵育1.5 h 后洗滌, 洗滌條件同步驟2.

步驟5 孵育酶標(biāo)二抗: 加100μL 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgE 二抗(1∶10 000),37?C 避光孵育1 h 后洗滌, 洗滌條件同步驟2.

步驟6 加底物顯色液: 加入TMB 底物顯色液200μL, 37?C 避光孵育20 min.

步驟7 終止反應(yīng): 加2 mol/L H2SO450μL 終止反應(yīng). 利用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450吸收值, 通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線估算被測(cè)樣品中變應(yīng)原蛋白的質(zhì)量濃度.

2 結(jié)果與討論

2.1 上海春季大氣顆粒物的粒徑分布

由圖1 可以看出, 2017 年春季采樣期間, 粒徑＞7 μm 的大氣顆粒物的質(zhì)量濃度為60～65μg/m3, 在3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0μm 的3 個(gè)粒徑段的大氣顆粒物的質(zhì)量濃度較為接近,粒徑＜1.1μm 的大氣顆粒物的質(zhì)量濃度為35～55μg/m3. 與上海市環(huán)境保護(hù)局發(fā)布的空氣質(zhì)量月報(bào)相比(http://www.sepb.gov.cn/fa/cms/xxgk//AC46/AC4602000/2017/05/96124.htm),PM2.5的質(zhì)量濃度大體一致, 但是粗顆粒的濃度有明顯變化, 其中本研究樣品中粗顆粒物的比例較高. 這可能是因?yàn)楸敬尾蓸訛榈乇聿蓸? 受到了地表?yè)P(yáng)塵的影響. 在＞7.0,3.3～7.0, 2.0～3.3μm 這3 個(gè)較大粒徑段內(nèi)的顆粒物質(zhì)量濃度在四月都有所升高, 但是1.1～2.0,＜1.1μm 小粒徑段內(nèi)的顆粒物質(zhì)量濃度并沒(méi)有升高. 這可能是由于四月份有一次沙塵天氣, 導(dǎo)致了空氣中粗顆粒物的增加[14]. 同時(shí)這也說(shuō)明細(xì)顆粒物是上海主要的大氣污染物, 這與本課題組以往的研究結(jié)果相符[15-16].

圖1 2017 年上海春季大氣顆粒物樣品的質(zhì)量濃度Fig.1 Mass concentrations of atmospheric particulate matter in the spring of Shanghai, 2017

2.2 大氣顆粒物中總蛋白的粒徑分布

從圖2 中可以看出, 在粒徑最小(＜1.1 μm)的顆粒物中, 總蛋白的平均質(zhì)量濃度為2.5～3.0 μg/m3, 且在整個(gè)采樣期內(nèi)總蛋白的質(zhì)量濃度最大值為4.8 μg/m3. 由圖1 和2 可以計(jì)算得到: 總蛋白占大氣顆粒物的2.5%～5.6%; 所有粒徑段的總蛋白的平均質(zhì)量濃度為6.26 μg/m3, 顆粒物的平均質(zhì)量濃度為176.38 μg/m3. 因此, 總蛋白質(zhì)量濃度在顆粒物中的平均比例為3.55%. 而且2017 年4 月6 日所采集到的樣品中的總蛋白主要集中在＞7.0 μm 粒徑段. 這可能與當(dāng)日的天氣情況有關(guān), 因?yàn)榻涤甓鴮?dǎo)致細(xì)顆粒中的蛋白質(zhì)量濃度偏低. Kang等[17]的研究發(fā)現(xiàn), 合肥地區(qū)的PM10中, 總蛋白來(lái)源主要有花粉、霉菌、細(xì)菌、真菌、孢子、昆蟲糞便、皮屑等, 平均質(zhì)量濃度為11.42 μg/m3, 且蛋白質(zhì)量濃度與降水量呈反比關(guān)系. 本研究中總蛋白質(zhì)量濃度及其日變化同樣符合這一規(guī)律.

圖2 大氣顆粒物中總蛋白的粒徑分布Fig.2 Size distributions of the total protein in atmospheric particulate matter

2.3 大氣顆粒物中致敏蛋白Pla a3 的粒徑分布

本研究采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量大氣顆粒物中致敏蛋白Pla a3 的質(zhì)量濃度. 每次實(shí)驗(yàn)都以相同的純化的rPla a3 蛋白為標(biāo)樣, 以50, 100, 200, 500, 1 000, 2 000 pg/mL 質(zhì)量濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 以此來(lái)測(cè)定顆粒物內(nèi)Pla a3 的質(zhì)量濃度. 由圖3 可見(jiàn): 大氣顆粒物中的致敏蛋白Pla a3 主要集中在＞7.0 μm 的粒徑段內(nèi), 其平均質(zhì)量濃度為7.5 pg/m3, 而且在此粒徑段內(nèi), 呈現(xiàn)先增多后降低的時(shí)間變化趨勢(shì), 與懸鈴木的花期相吻合; 在3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0μm 這3 個(gè)粒徑段內(nèi), Pla a3 蛋白的質(zhì)量濃度相差不大, 約為1.8 pg/m3; 在＜1.1μm 的粒徑段內(nèi), Pla a3 蛋白的質(zhì)量濃度最低, 約為0.5 pg/m3. 由圖2 和3 計(jì)算得到, Pla a3 蛋白占總蛋白的0.14%～0.29%. Fern′andez-Gonz′alez 等[18]的研究結(jié)果顯示, 在西班牙奧倫塞市的大氣中發(fā)現(xiàn)了懸鈴木花粉致敏蛋白Pla a1 的存在, 而在2013 年3 月28 日檢測(cè)到的Pla a1 蛋白的日最大質(zhì)量濃度為1.2 ng/m3. 同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn), 大氣中Pla a1 致敏蛋白的質(zhì)量濃度與當(dāng)?shù)氐钠骄鶞囟群妥罡邷囟瘸烧嚓P(guān), 與相對(duì)濕度呈負(fù)相關(guān). 而在本工作中, 檢測(cè)到大氣中致敏蛋白Pla a3 的日平均質(zhì)量濃度為15 pg/m3, 遠(yuǎn)低于致敏蛋白Pla a1 的質(zhì)量濃度. 這可能是因?yàn)閼意從净ǚ壑蠵la a3 蛋白的表達(dá)量遠(yuǎn)低于Pla a1 蛋白的表達(dá)量. 通過(guò)建立甄別大氣中Pla a3 致敏蛋白的質(zhì)量生物學(xué)模型, 測(cè)定大氣中Pla a3 致敏蛋白的質(zhì)量濃度水平, 可以為預(yù)防花粉癥及過(guò)敏性哮喘病提供一定的數(shù)據(jù)支持.

圖3 大氣顆粒物中致敏蛋白Pla a3 的粒徑分布Fig.3 Size distributions of Pla a3 protein in atmospheric particulate matter

3 結(jié) 論

(1) 采樣期間, 大氣顆粒物中的總蛋白主要集中在＜1.1μm 的粒徑段, 總蛋白質(zhì)量濃度約為2.5～3.0μg/m3. 顆粒物中的致敏蛋白Pla a3 主要集中在＞7.0μm 的粒徑段, 平均質(zhì)量濃度為8.7 pg/m3, 其時(shí)間變化趨勢(shì)與懸鈴木在花期釋放特征相吻合.

(2) 在總蛋白集中分布的粒徑段(＜1.1μm)內(nèi), 致敏蛋白Pla a3 的質(zhì)量濃度最低. 這可能是因?yàn)榧?xì)顆粒物中含有更多孢子、真菌等生物, 貢獻(xiàn)了其蛋白. 對(duì)于細(xì)顆粒物中其他致敏蛋白的分布特征, 還有待進(jìn)一步研究.