西瓜抗枯萎病菌生理小種1與2的 遺傳和染色體定位分析

任毅 焦荻 宮國(guó)義 張海英 郭紹貴 張潔 許勇

目的與意義：西瓜枯萎病是一種世界性的毀滅性土傳真菌病害，是導(dǎo)致全球西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)降低的最嚴(yán)重障礙。西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌引起的，研究西瓜抗枯萎病菌生理小種1和2的遺傳分析和染色體定位，將有利于高效改良栽培西瓜的枯萎病抗性，為開展西瓜抗枯萎病分子輔助育種提供技術(shù)支撐。

材料與方法：以來自中國(guó)優(yōu)良栽培品種‘97103與美國(guó)的栽培品種‘PI 296341-FR雜交的103個(gè)重組近交系（RIL）組成的F8群體為實(shí)驗(yàn)材料。每個(gè)品系挑選生長(zhǎng)一致的15株植物，用于枯萎病致病菌接種。其中‘Sugar Baby 和‘Black Diamond作為FON生理小種1（FON-1）感病品種對(duì)照，‘Charleston Gray‘Crimson Sweet和‘Calhoun Gray作為FON生理小種1的抗病品種對(duì)照?！瓹alhoun Gray作為FON生理小種2（FON-2）的感病品種對(duì)照，‘SY630作為FON生理小種2的抗病品種對(duì)照。結(jié)果使用SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析方差分析（ANOVA）。根據(jù)Knapp等人計(jì)算H2置信區(qū)（CI）。使用SAS在平均基礎(chǔ)上計(jì)算Pearson在所有環(huán)境中的性狀之間的表型相關(guān)系數(shù)。并檢測(cè)FON生理小種1和生理小種2抗性QTL，以及接種FON-2的SNP標(biāo)記。

結(jié)果與分析： 接種FON-1和FON-2后，‘97103的發(fā)病指數(shù)高于‘PI 296341-FR。在RIL群體中觀察到FON-2抗性的超親分離，而未檢測(cè)到FON-1和FON-2抗性的平均疾病指數(shù)的變化，平均疾病指數(shù)分別為0.53和0.66。

FON生理小種1和生理小種2抗性測(cè)試中，接種FON生理小種1后，第21天RILs系存活近一半，R：S=1：1，表明FON-1的抗性可能受1個(gè)主效QTL的控制。接種FON生理小種2后，RILs系中只有1/4存活，R：S預(yù)期比例為1：3，表明FON-2的抗性可能受兩個(gè)主效QTL的控制。值得注意的是，在FON-2接種后的第21天存活的23個(gè)植株中，有16個(gè)在接種FON-1后仍存活。因此選擇對(duì)FON-2具抗性的材料更有意義。

在‘97103與‘PI 296341-FR群體中檢測(cè)FON-1和FON-2抗性的QTL，檢測(cè)到FON-1的1個(gè)主要QTL。在1號(hào)染色體上檢測(cè)到的主效QTL（Qfon1.1）位于1bin2（5cM）和1bin3（7.1cM）之間，對(duì)于FON-1性狀，最大LOD=13.2，解釋了48.1%的表型變異?；趩螛?biāo)記分析檢測(cè)FON-1的最近標(biāo)記BVWS02309（655，755-655，染色體1上的903 bp）。如同預(yù)期，加性效應(yīng)值表明野生登記親本‘PI 296341-FR在Qfon1.1基因座上貢獻(xiàn)了有利的等位基因。在FON-1中發(fā)現(xiàn)的這個(gè)主效QTL比之前報(bào)道的6.1 cM（染色體1上的2.3-8.4 cM）具有更窄的定位區(qū)間（2.1 cM）因此，本研究中報(bào)道的標(biāo)記對(duì)于育種者選擇FON-1抗性是有價(jià)值的。

在9號(hào)染色體上檢測(cè)到FON-2（Qfon2.1）的第1個(gè)QTL位于在9bin8和9bin9之間，最大LOD=3.3，并解釋了13.7%的表型變異。 FON-2（Qfon2.2）的第2個(gè)QTL位于10bin35和10bin36之間的10號(hào)染色體上，最大LOD=3.1，解釋了12.5%的表型變異，正如所料，來自野生種質(zhì)親本‘PI 296341-FR的等位基因在QTL Qfon2.1對(duì)FON-2抗性有貢獻(xiàn)，而親本品種‘97103與檢測(cè)到的QTL Qfon2對(duì)FON-2抗性有關(guān)。這種現(xiàn)象表明，RIL群體中FON-2抗性可能發(fā)生超親遺傳，這可以解釋為什么一些RIL系具有比‘PI 296341-FR更高的抗性。

抗FON生理小種1的主要QTL區(qū)間含有84個(gè)基因。其中幾種可用于今后對(duì)西瓜FON生理小種1抗性的研究。一種受體激酶（Cla004916），一種葡聚糖內(nèi)切-1，3-葡糖苷酶前體（Cla004990）和3種位于FON-1 QTL和側(cè)翼1M基因組區(qū)域的酸性幾丁質(zhì)酶（Cla004914，Cla004920和Cla004921）。在Qfon2.1 QTL區(qū)域發(fā)現(xiàn)一種脂氧合酶（Cla014845）基因，5種受體樣激酶（Cla014853，Cla014955，Cla014972，Cla014725和Cla014728）和4種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Cla014674-Cla014677）基因。已知脂氧合酶蛋白參與植物的生物和非生物防御機(jī)制（Yan等人，2013），而受體激酶在病原體識(shí)別和植物的生長(zhǎng)和防御中起重要作用。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶參與谷胱甘肽依賴性解毒途徑，其在異生素的解毒中起關(guān)鍵作用。從該結(jié)果可以推斷，4種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可能參與賦予對(duì)真菌感染的抗性。在Qfon2.2中，存在一種精氨酸生物合成雙功能蛋白（Cla017879），2種受體激酶蛋白（Cla017918和Cla017919）和一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（Cla018045）。其中脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（LTP）基因沉默的轉(zhuǎn)基因番茄植物表現(xiàn)出對(duì)枯萎病的疾病易感性降低（Krasikov等，2011）。有趣的是，觀察到的癥狀減輕與已知的植物防御報(bào)告基因（PR-1和WIPI）的表達(dá)譜改變無關(guān)。這項(xiàng)工作表明，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白是番茄對(duì)枯萎病的完全易感性所必需的（Krasikov等，2011）?？紤]到親本栽培品種‘97103與檢測(cè)到的QTL Qfon2.2的FON-2抗性相關(guān)，有可能的是，易感性相關(guān)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（Cla018045）的低表達(dá)促成了RIL群體中的FON-2抗性。

使用20個(gè)重新測(cè)序的西瓜品種測(cè)試SNP標(biāo)記的有效性，所有20個(gè)重新測(cè)序的種質(zhì)都與FON-1_Chr1SNP_502124位點(diǎn)的FON-1表型相匹配，表明該標(biāo)記用于育種計(jì)劃的準(zhǔn)確性很高。雖然20個(gè)重新測(cè)序序列的種質(zhì)代表了所有3種類型的西瓜，但重新排序的種群規(guī)模并不大;因此，我們?cè)谟葿lack Diamond 和 Calhoun Gray雜交后代231株F2群體中測(cè)試了SNP標(biāo)記。接種FON生理小種1后第21天，F(xiàn)2群體中229株植物的表型與基于SNP標(biāo)記Chr1SNP_502124的基因型的預(yù)測(cè)一致，表明該SNP標(biāo)記可以有效地用于FON-1選擇。為了將FON-1抗性性狀引入商業(yè)雜交品種，使用FON1_Chr1SNP_502124進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇育種程序以選擇FON-1抗性。在FON-1_Chr1SNP_502124基因座上含有SY630基因型（雜合子）的所有植物在由中國(guó)優(yōu)良品系KYF 9 SY630雜交產(chǎn)生的61株BC1群體中顯示出FON-1抗性。

結(jié)? ? 論： 在‘97103與‘PI 296341-FR群體中檢測(cè)到的主效QTL（Qfon1.1）比之前報(bào)道的6.1 cM（染色體1上的2.3～8.4 cM）具有更窄的間隔（2.1 cM），并開發(fā)了FON-1_Chr1SNP_502124分子標(biāo)記，該標(biāo)記對(duì)于育種者選擇FON-1抗性是有價(jià)值的。在9和10號(hào)染色體上分別檢測(cè)到一個(gè)QTL FON-2（Qfon2.1）和FON-2（Qfon2.2），在Qfon1.1 QTL區(qū)域發(fā)現(xiàn)1種受體激酶（Cla004916），1種葡聚糖內(nèi)切-1，3-葡糖苷酶前體（Cla004990）和3種位于FON-1 QTL和側(cè)翼1M基因組區(qū)域的酸性幾丁質(zhì)酶（Cla004914，Cla004920和Cla004921）。在Qfon2.1 QTL區(qū)域發(fā)現(xiàn)一種脂氧合酶（Cla014845）基因，5種受體樣激酶（Cla014853，Cla014955，Cla014972，Cla014725和Cla014728）和4種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Cla014674-Cla014677）基因。在Qfon2.2中，存在1種精氨酸生物合成雙功能蛋白（Cla017879），2種受體激酶蛋白（Cla017918和Cla017919）和1種脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（Cla018045）。