HPLC-MS/MS法測定大鼠血漿樣品中4-FMA含量

鄭茜，溫美強，2，賈娟，王濤，尉志文，馬紅娟，王優(yōu)美，徐鵬，贠克明

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110000；3.公安部禁毒情報技術(shù)中心 國家毒品實驗室，北京 100193）

新精神活性物質(zhì)（new psychoactive substance，NPS）是不法分子為逃避打擊而對管制毒品進行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾得到的毒品類似物，具有與管制毒品相似或更強的興奮、致幻、麻醉等效果，成為繼傳統(tǒng)毒品、合成毒品后全球流行的第三代毒品[1]。

4-氟甲基苯丙胺（4-fluoromethamphetamine，4-FMA）屬于苯丙胺類NPS[2]，能夠通過誘導(dǎo)多巴胺、去甲腎上腺素及5-羥色胺的釋放，產(chǎn)生較強的神經(jīng)興奮和致幻作用，活性比苯丙胺及甲基苯丙胺（methamphetamine，MA）更強[3]。國家市場監(jiān)督管理總局（原國家食品藥品監(jiān)督管理總局）于2015年將其列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》進行管控。由于4-FMA出現(xiàn)較晚，管制較遲，對于4-FMA的檢測研究還未充分開展，目前報道的生物檢材涉及頭發(fā)[4]、唾液[5]及血清[6]樣品。本研究擬建立大鼠血漿中4-FMA的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法，為4-FMA在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

6460三重四級桿高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），TGL-16B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），Vortex-Genie 2渦旋混合器（美國Scientific Industries公司），移液槍（德國Eppendorf公司），Milli-Q?Integral超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore公司）。

4-FMA、MA由公安部禁毒情報技術(shù)中心提供；甲醇、乙腈為色譜純，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；實驗用水為實驗室自制超純水。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，質(zhì)量約250 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。雌雄分籠，自由攝食和飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。室溫控制在25℃左右，相對濕度維持在60%～70%，晝夜周期條件為12h光照、12h黑暗。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Poroshell 120 EC-C18柱（50mm×3.0mm，2.7 μm，美國Agilent公司），流動相由含0.1%甲酸的水溶液與含0.1%甲酸的乙腈溶液（體積比為85∶15）組成，流速為0.4mL/min，柱溫25℃，進樣量2μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，離子源溫度為300℃，霧化器溫度305℃；氮氣流速為11.0 L/min，毛細管電壓4000V；采用正離子模式、多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析。

1.4 儲備液、工作液及校正標(biāo)樣的制備

分別精密稱取10 mg 4-FMA和MA標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成1.0 mg/mL的4-FMA和MA儲備液。精密吸取MA儲備液適量，用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為2.5μg/mL的MA內(nèi)標(biāo)工作液。取4-FMA儲備液適量，經(jīng)甲醇逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為 10 000、5 000、2 500、1 000、500、250、100、50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和質(zhì)量濃度分別為100、2500、10000ng/mL的低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品工作液。

1.5 血漿樣品處理

精密吸取血漿樣品100μL，置于1.5mL塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)MA（2500ng/mL）10μL、甲醇500μL，渦旋混合30 s，以離心半徑10 cm，13 000 r/min，離心10 min，取上清液400 μL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣量為2μL。

1.6 大鼠體內(nèi)實際應(yīng)用

取Wistar大鼠3只，體質(zhì)量250 g，灌胃給予4-FMA 26mg/kg，于給藥前及給藥后0.5、1.0、3.0h分別通過眼眶取血0.5mL。采用1.5節(jié)方法處理并檢測分析（超出線性范圍者用超純水稀釋后再進行分析）。

1.7 方法學(xué)考察

專屬性：將空白血漿、空白血漿加標(biāo)樣品和染毒大鼠血漿樣品按1.5節(jié)處理后進樣分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：取100 μL空白血漿，加入不同質(zhì)量濃度的4-FMA標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液或質(zhì)控樣品工作液10 μL，配成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100、250、500、1000ng/mL的血漿樣品，按1.5節(jié)處理后進樣分析。

檢出限和定量限：考察4-FMA質(zhì)量濃度為1、3、5ng/mL時的信噪比（S/N），以S/N≥3作為檢出限（limit of detection，LOD），S/N≥5作為定量限（limit of quantitation，LOQ）并對LOQ進行準(zhǔn)確度和精密度考察。

精密度、準(zhǔn)確度：配制低、中、高3個質(zhì)量濃度（10、250、1000ng/mL）的血漿質(zhì)控樣品，按1.5節(jié)處理后進樣分析并計算，每個質(zhì)量濃度平行6份。同日測定，得日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3d，得日間精密度。精密度均以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示，準(zhǔn)確度均以相對誤差（relative error，RE）表示。

提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)：取低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品100μL，按1.5節(jié)處理后進樣分析，設(shè)待測物MRM峰面積為A。取低、中、高3個質(zhì)量濃度的質(zhì)控溶液10 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μL和經(jīng)前處理后的6種不同來源的空白血漿提取液600μL，進樣分析，記錄待測物MRM峰面積為B，將待測物與內(nèi)標(biāo)物MRM峰面積比值設(shè)為X，按公式A/B×100%計算待測物提取回收率。另取低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控溶液10μL，分別依次加入內(nèi)標(biāo)溶液10μL、甲醇600μL，進樣分析，記錄待測物與內(nèi)標(biāo)物MRM峰面積比值為C。按公式X/C×100%計算待測物內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子[7]。每個質(zhì)量濃度均平行6次。

穩(wěn)定性：分別考察低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿質(zhì)控樣品在24 h內(nèi)3次反復(fù)凍融的穩(wěn)定性[8]（25℃→-20℃）、長期凍存穩(wěn)定性（-20℃冰箱冷凍放置15d）、樣品制備后室溫（25℃）放置4h的穩(wěn)定性以及4℃放置24h的穩(wěn)定性，計算不同處理后樣品檢測的準(zhǔn)確度和精密度，如結(jié)果絕對值均不超過15%則認(rèn)為穩(wěn)定性良好。

殘留效應(yīng)：在高質(zhì)量濃度（1000ng/mL）樣品進樣后立即進一個空白樣品，考察待測物與內(nèi)標(biāo)的殘留效應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 儀器條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件優(yōu)化通過調(diào)節(jié)質(zhì)譜的碎裂電壓和碰撞能量值，使得離子的響應(yīng)值最佳。4-FMA和MA的MRM離子及所需裂解電壓、碰撞能量等見表1。

表1 4-FMA、MA的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 方法學(xué)考察

專屬性：血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾4-FMA與MA的測定，具有較高的專屬性，如圖1所示，4-FMA和MA的保留時間分別為1.93和1.51min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：以4-FMA的質(zhì)量濃度為自變量（x），4-FMA與MA的定量離子對峰面積比值為因變量（y），采用加權(quán)最小二乘法（權(quán)重系數(shù)1/x2）進行線性回歸，可得4-FMA血漿質(zhì)量濃度為5～1000ng/mL時的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0004+0.0031x（r=0.9992）。

檢出限和定量限：4-FMA血漿樣品的LOD為3 ng/mL，LOQ為5 ng/mL，在質(zhì)量濃度為5 ng/mL時樣品的準(zhǔn)確度和精密度分別為0.16%和3.21%。

精密度、準(zhǔn)確度：4-FMA 3個質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD值均小于8.16%，準(zhǔn)確度為-2.0%～3.2%。精密度和準(zhǔn)確度均良好，見表2。

提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)：結(jié)果顯示提取回收率＞90%，RSD＜5.62%。4-FMA質(zhì)控樣品低、中、高3個質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子分別為101.0%、97.0%、100.0%，大鼠血漿基質(zhì)對4-FMA測定的影響可以忽略，詳見表2。

圖1 4-FMA與內(nèi)標(biāo)物MA的MRM色譜圖

穩(wěn)定性：處理后樣品經(jīng)24 h內(nèi)3次反復(fù)凍融（25℃→-20℃）、長期凍存（-20℃，15d）、室溫（25℃）放置4 h、4℃放置24 h后均能穩(wěn)定存在，檢測樣品的相對偏差為-10.7～9.2%，符合要求。

殘留效應(yīng)：結(jié)果顯示，待測物與內(nèi)標(biāo)在高濃度進樣后均沒有殘留。

2.3 實際應(yīng)用

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算得到大鼠血漿中4-FMA的含量，詳見表3。

表3 大鼠給予4-FMA前及給藥后不同時間的血藥質(zhì)量濃度 （ng/L）

3 討 論

目前，國內(nèi)外對苯丙胺類的毒品檢測多采用氣相色譜（gas chromatography，GC）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]、LC-MS/MS[11-12]等方法。相對于其他方法，本研究所建立的HPLC-MS/MS法不需要衍生化，分析時間只需2.5 min；檢測靈敏度高，能達到3 ng/mL；采用MRM模式，選取兩個離子對定性，準(zhǔn)確度好。在實際毒品檢測實踐中，所能獲得的血液樣品量往往較少，毒物含量很低，且要求很快得出結(jié)果。本研究所建立的HPLC-MS/MS法能滿足血漿樣品中4-FMA的檢測需求。

本研究所建立的大鼠血漿樣品中4-FMA含量的HPLC-MS/MS測定方法，以MA為內(nèi)標(biāo)，采用甲醇沉淀蛋白后直接進樣分析，操作簡單、快速，可避免因操作繁瑣引起誤差，并且降低了檢測成本。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確性、精密度、提取回收率均良好，LOQ達到5ng/mL，能夠?qū)ξ⒘繕悠愤M行準(zhǔn)確定量。實際應(yīng)用證明本方法能夠滿足大鼠體內(nèi)毒代動力學(xué)研究檢測要求，為了解4-FMA在動物體內(nèi)的動力學(xué)特征和分布，以及對其毒理學(xué)研究和NPS濫用的司法鑒定提供了方法基礎(chǔ)。