免疫組織化學(xué)法鑒定蛇咬傷中毒1例

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430030）

1 案 例

1.1 簡要案情

某女，67歲，農(nóng)民，某年3月4日20：00許在家中睡覺時被蛇咬傷，當(dāng)晚至3月6日每日到當(dāng)?shù)匾粺o證蛇醫(yī)診所就醫(yī)，并訴失眠、全身疼痛及右下肢腫脹，3月7日08：00許在家中死亡。毒蛇經(jīng)鑒定為當(dāng)?shù)氐某Ｒ姸旧摺L江短尾蝮蛇。

1.2 法醫(yī)學(xué)檢驗

尸體解剖：腦水腫顯著，雙側(cè)海馬溝回疝及小腦扁桃體疝形成；喉頭、腭扁桃體、甲狀腺及食管大體未見異常，舌下腺小片狀出血，心表面及心底多發(fā)點狀出血，肝、脾、腎等腹腔器官外觀未見異常；右下肢、右足背高度腫脹，顏色呈暗紅至青紫色，右外踝見3處點狀出血（疑似毒蛇牙痕），出血點周圍表皮剝脫，其下2.0cm見一處針刺傷伴周圍組織紅腫（圖1）；切開右下肢、右足見皮膚、皮下軟組織及肌肉廣泛出血、壞死，大量暗紅色水腫液流出（圖2）；左下肢、左足大體未見異常。

圖1 右外踝蛇咬傷牙痕

圖2 右外踝皮下軟組織出血、壞死

組織病理學(xué)檢驗：腦各部淤血、水腫顯著，小腦顆粒細(xì)胞壞死、浦肯野細(xì)胞腫脹，垂體神經(jīng)部水腫顯著；部分小血管周圍少量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，部分小血管周圍少量出血，少數(shù)小血管周圍含鐵血黃素顆粒沉積。舌下腺部分腺管片狀壞死、出血伴纖維素滲出，部分神經(jīng)節(jié)水腫，腭扁桃體部分淋巴小結(jié)壞死。心外膜少量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，左心室、室間隔及乳頭肌間質(zhì)水腫明顯，散在灶片狀出血，可見大量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，心內(nèi)膜下部分浦肯野細(xì)胞水樣變性伴收縮帶壞死，右心室間質(zhì)散在小片狀出血伴少量炎癥細(xì)胞浸潤；冠狀動脈左主干及右主干心外膜多發(fā)片狀出血；心傳導(dǎo)系統(tǒng)檢查示竇房結(jié)區(qū)水腫顯著伴外膜片狀出血，部分傳導(dǎo)細(xì)胞水樣變性，房室結(jié)及希氏束部分傳導(dǎo)細(xì)胞水樣變性，部分小血管內(nèi)透明血栓形成。肝包膜下肝索變窄斷裂，肝細(xì)胞水樣變性，肝細(xì)胞內(nèi)膽汁淤積，肝竇內(nèi)中性粒細(xì)胞比例增高。脾多發(fā)片狀出血，部分脾小體淋巴細(xì)胞壞死，可見少量中性粒細(xì)胞浸潤、巨噬細(xì)胞活化及纖維素滲出。腎皮質(zhì)部分腎小球周圍近曲小管上皮細(xì)胞水腫顯著，部分細(xì)胞脫落入管腔，部分腎近曲小管管腔內(nèi)見血性原尿，腎小管內(nèi)大量蛋白管型、細(xì)胞管型、顆粒管型及纖維素管型，腎盂多發(fā)片狀出血。右下肢、右足皮下結(jié)締組織膠原纖維凝固性壞死、崩解，大面積出血、水腫，以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤以及大量條索狀纖維素滲出；肌細(xì)胞廣泛凝固性壞死、崩解、脫失，部分殘存肌細(xì)胞空泡樣變性，間質(zhì)有大量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，可見少量嗜酸性粒細(xì)胞；部分細(xì)小血管管壁纖維素性壞死，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，部分小血管內(nèi)紅細(xì)胞溶血明顯，部分細(xì)小血管內(nèi)透明血栓形成；部分神經(jīng)節(jié)水腫明顯（圖3）。左下肢、左足鏡下均未見異常。

圖3 右外踝皮下組織急性蜂窩織炎（HE×100）

免疫組織化學(xué)檢驗：利用蝮蛇蛇毒蛋白抗體（antiechidnotoxin）對雙下肢及踝部皮膚、肝、腎組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，結(jié)果顯示右外踝皮膚炎癥細(xì)胞呈陽性表達(dá)（圖4）。

圖4 右外踝皮下蝮蛇蛇毒蛋白抗體免疫組織化學(xué)染色（×100）

法醫(yī)病理學(xué)診斷：右外踝蛇咬傷伴組織壞死及急性蜂窩織炎；右下肢軟組織及肌肉廣泛壞死、出血，彌散性血管內(nèi)凝血；中毒性心肌??；中毒性肝?。恢卸拘阅I?。恢卸拘阅X??；多發(fā)性淋巴組織壞死。

死亡原因：本例系蝮蛇咬傷中毒致全身多器官功能衰竭死亡。

2 討 論

蛇毒是由毒蛇的毒腺通過毒牙排放出來的一種毒性非常強(qiáng)的毒素，對人的生命威脅很大。毒蛇咬傷常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在非洲、亞洲、大洋洲和拉丁美洲的農(nóng)村地區(qū)，毒蛇咬傷是特別突出的公共衛(wèi)生問題，據(jù)估計，全球每年有超過200萬人被蛇咬傷，造成20000～94000人死亡[1]。在我國，毒蛇咬傷多見于南方地區(qū)，據(jù)調(diào)查，我國每年被毒蛇咬傷者有10萬人以上，死亡人數(shù)在1萬以上[2]。毒蛇咬傷絕大多數(shù)為意外事件，但也有利用毒蛇自殺或他殺的案例[3-6]。

臨床上對蛇傷的鑒定主要依靠觀察牙痕和癥狀檢查，其中牙痕是關(guān)鍵，但這些依據(jù)在法醫(yī)病理學(xué)診斷中仍存在較大問題。由于毒蛇種類繁多、成分復(fù)雜，且蛇毒致死案例絕大多數(shù)為意外事件，很少進(jìn)入法醫(yī)鑒定程序，導(dǎo)致蛇毒中毒的法醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展緩慢，并且在法醫(yī)學(xué)鑒定中常發(fā)生沒有發(fā)現(xiàn)牙痕的情形，或者即便發(fā)現(xiàn)牙痕，如何判斷是否為蛇毒中毒以及確定毒蛇種屬，是此類鑒定的關(guān)鍵和難題。

蛇毒的毒性成分主要是具有酶活性的蛋白質(zhì)和多肽，按有毒成分的毒理作用可分為神經(jīng)毒、血液毒和混合毒。不同種類的蛇毒其所含的蛋白質(zhì)和多肽的抗原特異性，為利用免疫組織化學(xué)方法鑒定蛇毒中毒提供了可能，免疫組織化學(xué)方法也成為蛇毒蛋白鑒定的主要研究方法[7]。

長江短尾蝮蛇蛇毒是以神經(jīng)毒素為主兼有出血毒素的混合毒，是我國十大毒蛇之一，其神經(jīng)毒素含量較低，約占毒素干重的1%～2%，主要化學(xué)成分是由15～18種氨基酸、60～74個氨基酸鏈結(jié)合而成的肽鏈，主要通過對神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)阻滯引起全身肌肉酸痛、四肢麻木無力等多方面的中毒癥狀；其出血毒素中含有多種成分，如蛋白水解酶、精氨酸酯酶和磷脂酶A2家族等，蛇毒中的溶血素、凝血素蛋白水解酶等毒性物質(zhì)，使血紅細(xì)胞溶解并破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起廣泛溶血和出血[8]。蝮蛇咬傷者局部腫脹疼痛、皮下淤血、組織壞死，蛇毒對心血管系統(tǒng)也有一定的損害，可直接或間接損害心肌，導(dǎo)致心肌炎，使血液循環(huán)障礙、血壓下降、休克或心力衰竭。長江短尾蝮蛇蛇毒幾乎對人體各個系統(tǒng)器官組織都有毒性作用，如促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白，形成凝血沉積于毛細(xì)血管，加之溶血毒素出現(xiàn)溶血，直接損傷腎小球及腎小管，引起急性腎功能衰竭[8]。本例根據(jù)案情調(diào)查顯示有毒蛇咬傷病史，且毒蛇種類明確，尸體檢驗示右下肢腫脹并皮下軟組織及肌肉廣泛壞死出血、中毒性肝病、中毒性腎病等，雖然推測蛇毒中毒可能性較大，但如果需要確診系蛇毒中毒，則必須進(jìn)行毒物分析或蛇毒的鑒定。免疫組織化學(xué)技術(shù)是一種非常靈敏的檢測技術(shù)，借助抗原-抗體結(jié)合的高特異性，可對蛇毒的種屬進(jìn)行鑒定，而且其操作簡單、快捷，是一種較好的蛇毒種屬鑒定方法。但目前由于對蛇毒蛋白和蛇毒抗體的研究還不夠全面，商品化抗體較少，在實踐中應(yīng)用較少。本例即運(yùn)用長江短尾蝮蛇蛇毒的特異性抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，在死者咬傷局部、肝、腎等處的炎癥細(xì)胞中檢測出蝮蛇蛇毒成分，最終確定死亡原因為蝮蛇咬傷致全身多器官功能衰竭而死亡。

在法醫(yī)學(xué)鑒定工作中，對疑似蛇毒中毒的案件應(yīng)注意以下幾點：（1）案情調(diào)查應(yīng)全面、詳細(xì)，需查明是否系毒蛇咬傷以及明確毒蛇種類等信息；（2）收集詳細(xì)的病歷資料，醫(yī)院的輔助檢查尤為重要，可能會提示毒素種類，如有可能，可邀請有經(jīng)驗的蛇醫(yī)及專家進(jìn)行鑒定；（3）在系統(tǒng)解剖的基礎(chǔ)上，對懷疑毒蛇咬傷的部位及對側(cè)組織進(jìn)行分層解剖及提取，確定是否存在毒蛇的牙痕；（4）常規(guī)提取懷疑咬傷處皮膚、肌肉、擠出液或血液等組織成分，分別進(jìn)行冷凍保存或多聚甲醛及中性甲醛固定，進(jìn)行抗蛇毒免疫熒光或其他免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測，確認(rèn)是否系蛇毒中毒及明確毒蛇的種類，同時提取對稱未咬傷部位的正常皮膚、肌肉等組織作為對照；（5）懷疑蛇毒中毒的案件，現(xiàn)場勘驗也非常重要，應(yīng)注意發(fā)現(xiàn)、尋找并提取裝蛇的容器（如竹筒、布袋或蛇皮袋等）、衣物等，檢驗毒蛇鱗片、蛇蛻及衣物破口等；（6）新鮮組織的蛇毒檢測率明顯高于腐敗尸體，但對懷疑蛇毒中毒致死者，腐敗尸體或開棺驗尸對蛇毒的檢測依然具有一定價值[5，9]。本例根據(jù)案情調(diào)查已提示毒蛇種屬，選擇抗體時有一定的方向性，但對于事先無任何信息可以參考的案例，仍然需要通過現(xiàn)代分析技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行深入研究，為此類案件的偵破提供科學(xué)方法和鑒定依據(jù)。