基于聚鄰苯三酚修飾的甲霜靈分子印跡傳感器制備與應(yīng)用

王春瓊，彭麗娟，李籽萱，張 燕，李 苓，陳 丹，曾彥波，李 鄲，劉宇晨，曹秋娥*

1. 云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站, 昆明市高新開(kāi)發(fā)區(qū)科醫(yī)路41 號(hào) 650106

2. 云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明市五華區(qū)翠湖北路2 號(hào) 650091

3. 紅云紅河煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司會(huì)澤卷煙廠，云南省曲靖市會(huì)澤縣金鐘鎮(zhèn)東郊 654200

煙草中農(nóng)藥殘留的控制是保證煙草制品吸用安全的重要手段，近年來(lái)一直是煙草行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。煙草農(nóng)殘的有效檢測(cè)技術(shù)研究不僅對(duì)于保障煙葉質(zhì)量和煙草企業(yè)的利益有重要意義，而且對(duì)于保障消費(fèi)者健康和生態(tài)環(huán)境安全也非常重要。甲霜靈[1]是一種廣譜、高效、低毒的內(nèi)吸殺菌劑，在煙草上施用非常廣泛。盡管甲霜靈是低毒類(lèi)農(nóng)藥，但由于其使用量不斷提高、使用范圍不斷擴(kuò)大，其環(huán)境生態(tài)、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題引起了廣泛的關(guān)注，世界各國(guó)對(duì)植物中甲霜靈殘留量[2]都有明確的規(guī)定。因此研發(fā)出一種對(duì)甲霜靈進(jìn)行快速、準(zhǔn)確和高靈敏度定量分析方法顯得尤為重要。目前，甲霜靈的檢測(cè)方法主要有液相色譜法（LC）[3-5]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[7-12]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[12-13]，但這些方法存在成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、樣品前處理操作繁瑣等不足[14]。分子印跡傳感器是以基于分子印跡技術(shù)制備的印跡敏感膜為識(shí)別元件，能夠?qū)Ｒ蛔R(shí)別目標(biāo)分子，具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、抗惡劣環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已被用于環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物分析和農(nóng)殘檢測(cè)等領(lǐng)域[15-16]。目前，采用分子印跡傳感器測(cè)定煙草農(nóng)殘甲霜靈的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，利用鄰苯三酚中苯環(huán)上羥基對(duì)電極信號(hào)的放大作用，先在玻碳電極表面修飾一層鄰苯三酚，再以甲霜靈為模板，苯酚為功能單體，在鄰苯三酚修飾玻碳電極表面通過(guò)電聚合制備甲霜靈分子印跡膜，以構(gòu)建一種應(yīng)用簡(jiǎn)單、測(cè)定快速、結(jié)果準(zhǔn)確、選擇性和靈敏度高的傳感器，為檢測(cè)煙草農(nóng)藥殘留甲霜靈提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

4 個(gè)初烤煙葉樣品（2018 年產(chǎn)自云南曲靖、C3F 等級(jí)）由云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站提供；空白煙葉基質(zhì)由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

苯霜靈、烯酰嗎啉、甲霜靈、氟嗎啉、樂(lè)果和百菌清（標(biāo)準(zhǔn)品，99.99%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司）；苯酚、鄰氨基酚、鄰苯二胺、鄰苯三酚和間苯二胺（AR，天津光復(fù)化工研究院）；Al2O3拋光粉（0.5 m，50 nm，純度大于99%，浙江理協(xié)儀器設(shè)備有限公司）；去離子水（18.25 MΩ·cm）。

CHI660 型電化學(xué)工作站[采用三電極系統(tǒng)：工作 電 極為 玻 碳 電 極（glassy carbon electrode，GCE）及各種修飾玻碳電極，輔助電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極；上海辰華儀器有限公司]；6470 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS，美國(guó)Agilent 公司）；AE-200 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；Millipore 超純水儀（德國(guó)Merck Millipore 公司）。

1.2 方法

1.2.1 玻碳電極預(yù)處理

1.2.2 聚鄰苯三酚修飾電極的制備

稱(chēng)取1.51 mg 鄰苯三酚于10 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，混勻后得到濃度為1.2 mmol/L 的鄰苯三酚溶液；將預(yù)處理好的玻碳電極置于上述溶液中，浸泡10 min，用循環(huán)伏安（cyclicvoltammetry，CV）在-0.4～1.0 V 電位范圍內(nèi)以20 mV/s 速率聚合10 次，使鄰苯三酚聚合膜沉積在玻碳電極表面；將電極用去離子水沖洗表面后，置于0.1 mol/L NaOH中，以100 mV/s 速率在-0.4～1.0 V 電位范圍內(nèi)掃3次CV 以去除電極表面未聚合的鄰苯三酚，得到鄰苯三酚修飾玻碳電極。

1.2.3 甲霜靈印跡傳感器的制備

甲霜靈印跡傳感器的制備過(guò)程如圖1 所示。將0.16 mmol 苯酚和0.01 mmol 甲霜靈溶于10 mL硼砂-硼酸緩沖液（pH=9.0）中，通N2（＞99.999%）20 min 除氧，制得預(yù)聚合液；將修飾電極浸于預(yù)聚合液中以50 mV/s 速率在0.3～0.8 V 電位范圍內(nèi)掃40 次CV，使鄰苯三酚修飾玻碳電極表面沉積甲霜靈分子印跡膜；聚合完成后，將印跡電極浸于甲醇/乙酸（體積比3∶1）的洗脫液中，用磁力攪拌洗脫20 min 以去除模板分子甲霜靈。非印跡傳感器除不加模板分子外，其余步驟均同于印跡傳感器。

圖1 甲霜靈印跡傳感器的制備過(guò)程示意圖Fig.1 Preparation process of metalaxyl molecular imprinted sensor

1.2.4 電化學(xué)檢測(cè)

將三電極系統(tǒng)放入待測(cè)溶液[以5.0 mmol/L K3Fe（CN）6為探針，0.1 mol/L KCl 為支持電解質(zhì)]；待背景電流穩(wěn)定，參照文獻(xiàn)[17]的電化學(xué)條件利用CV 和差示脈沖法（differential pulse voltammetry，DPV）表征修飾電極的電化學(xué)性能。其中，CV 測(cè)定條件：掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速率100 mV/s；DPV 測(cè)定條件：掃描范圍和速率同CV，振幅0.05 V，電位增量0.004 V，脈沖寬度0.05 s，采樣寬度0.016 s。

裸玻碳電極直接測(cè)定；各修飾電極須先在待測(cè)液中吸附2 min 后再測(cè)定。測(cè)定完畢，用洗脫液洗脫20 min，保存于4 ℃冰箱待用。

1.2.5 煙草樣品前處理

①電分析方法前處理。稱(chēng)取1.0 g 煙末試樣于25 mL 聚乙烯離心管中，加入10 mL 乙腈作為萃取液，超聲提取10 min；過(guò)濾后加入3 g NaCl，靜置；分層后取上層乙腈溶液1.5 mL 加入150 mg 無(wú)水硫酸鎂和25 mg N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑凈化，過(guò)濾后待檢測(cè)。

②LC-MS/MS 法前處理。稱(chēng)取2.0 g 煙末試樣于50 mL 聚乙烯離心管中，加入10 mL 水，振蕩至煙末被充分浸潤(rùn)；靜置10 min 后加入10 mL 乙腈和100 μL 內(nèi)標(biāo)工作液（20μg/mL 甲霜靈甲苯溶液），2 000 r/min 下渦旋振蕩2 min；置于冰箱冷凍室（-18 ℃）10 min，向聚乙烯管中加入試劑凈化包，2 000 r/min 下渦旋振蕩2 min；4 000 r/min 下離心5 min，取上清液1.5 mL 于2 mL 試劑凈化管，2 000 r/min 下渦旋2 min；4 000 r/min 下離心5 min，收集上清液待測(cè)。

1.2.6 農(nóng)藥殘留量的計(jì)算

以干基計(jì)的甲霜靈農(nóng)藥殘留量R，以毫克每千克（mg/kg）表示，按公式（1）計(jì)算：

式中：R—以干基計(jì)的農(nóng)藥殘留量（mg/kg）；C—由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)計(jì)算得到的結(jié)果（μmol/L）；V—萃取液體積（mL）；M—甲霜靈摩爾質(zhì)量（g/mol）；m—樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲霜靈分子印跡膜的表征

圖2 為鄰苯三酚修飾電極在含甲霜靈的苯酚預(yù)聚合液中的電聚合圖。可以看出：甲霜靈的電聚合過(guò)程完全不可逆，第1 次CV 掃描在0.7 V 左右出現(xiàn)明顯氧化峰，說(shuō)明苯酚聚合物在電極表面沉積。隨著CV 掃描次數(shù)的增加，苯酚在電極表面逐漸形成絕緣聚合膜，抑制了電極表面的伏安響應(yīng)，使氧化峰逐漸消失，電流響應(yīng)逐漸減弱，聚合反應(yīng)不再發(fā)生。

2.2 傳感器的分子印跡效應(yīng)

圖2 苯酚電聚合苯酚循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of electropolymerization phenol

由于印跡膜中印跡孔穴可作為電子傳質(zhì)通道，通道中發(fā)生的分子識(shí)別行為可改變電活性物質(zhì)的量，使鐵氰化鉀的氧化電流信號(hào)發(fā)生變化，因此可通過(guò)鐵氰化鉀氧化還原的電流信號(hào)研究膜的形態(tài)特征并間接分析被測(cè)物濃度[18]。甲霜靈在-0.2～0.6 V 電位范圍內(nèi)不出峰，因此借助鐵氰化鉀來(lái)表征各修飾電極，結(jié)果如圖3 所示。曲線(xiàn)a 為裸玻碳電極，當(dāng)電極表面修飾鄰苯三酚膜后，峰電流顯著增大，達(dá)180μA，表明修飾的鄰苯三酚具有較大的比表面積和良好的導(dǎo)電性能（曲線(xiàn)b）。當(dāng)甲霜靈印跡膜沉積到鄰苯三酚電極表面，由于電極表面被一層致密的不導(dǎo)電膜覆蓋，無(wú)傳質(zhì)通道，氧化還原峰消失（曲線(xiàn)c）。當(dāng)用洗脫液去除模板分子后，由于膜中印跡孔穴的形成，探針可通過(guò)孔穴到達(dá)電極表面發(fā)生反應(yīng)，從而峰電流重新增加（曲線(xiàn)d）。在曲線(xiàn)e 中，峰電流減小的原因是印跡膜再次吸附甲霜靈，使得傳質(zhì)通道被堵塞。而非印跡傳感器由于不存在印跡孔穴，所以洗脫前（曲線(xiàn)f）、后（曲線(xiàn)g）均不存在氧化還原反應(yīng)。

2.3 電化學(xué)傳感器制備條件優(yōu)化

2.3.1 聚合底液組成的影響及優(yōu)化

單體種類(lèi)及其與模板分子的濃度比對(duì)聚合膜性能有較大的影響[19]。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)聚合底液中模板與單體的濃度比進(jìn)行了優(yōu)化。配制模板/單體摩爾比為1∶8，1∶12，1∶16，1∶20 和1∶24 的聚合底液制備系列傳感器，結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)模板/單體摩爾比為1∶16 時(shí)，傳感器對(duì)8×10-6mol/L 甲霜靈有最大的響應(yīng)電流。

2.3.2 電聚合次數(shù)的優(yōu)化

電聚合過(guò)程中掃描次數(shù)對(duì)傳感器的影響見(jiàn)圖5?？梢钥闯觯酆蠏呙?0、30、40、50 和60 次的傳感器對(duì)模板分子響應(yīng)值先增大后減小，當(dāng)掃描40次時(shí)響應(yīng)電流最大。這可能是由于隨著聚合次數(shù)的增加，分子印跡膜逐漸變厚，位于印跡膜內(nèi)部的模板分子不能完全洗脫[20]，從而導(dǎo)致傳感器的靈敏度降低。因此選擇電聚合掃描次數(shù)為40 次。

圖3 印跡傳感器（A）和非印跡傳感器（B）的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of molecularly imprinted sensor（A）and non-imprinted sensor（B）

圖4 模板/單體摩爾比對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.4 Effect of template/monomers ratio on response of sensor

圖5 電聚合掃描次數(shù)對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.5 Effect of polymerization cycles on response of sensor

2.3.3 緩沖液pH 的影響

在苯酚濃度0.016 mol/L 條件下，改變聚合底液硼砂緩沖液的pH（7.1，8.0，8.4 和9.0），制備系列傳感器，并用DPV 法考察傳感器對(duì)甲霜靈的響應(yīng)。結(jié)果（圖6）表明，隨著pH 的增大，傳感器的響應(yīng)值增加，當(dāng)pH=9.0 時(shí)，制得的傳感器對(duì)8×10-6mol/L 甲霜靈的響應(yīng)電流最大，說(shuō)明在此條件下，識(shí)別位點(diǎn)被占據(jù)較多，分子印跡效果較好。因此，選擇pH=9.0 的硼砂緩沖液作為聚合基底液。

圖6 硼砂緩沖液pH 對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.6 Effect of borax buffer solution pH on response of sensor

2.3.4 模板洗脫液及時(shí)間的確定

非共價(jià)型分子印跡聚合物模板去除中常用的洗脫劑是甲醇與乙酸的混合液，本實(shí)驗(yàn)中選取不同體積比（2∶1，3∶1，4∶1）的甲醇/乙酸來(lái)去除模板分子。結(jié)果表明：體積比為3∶1 的甲醇/乙酸去除模板效果最好；2∶1 的甲醇/乙酸難以洗脫模板；4∶1 的甲醇/乙酸會(huì)導(dǎo)致印跡膜輕微溶脹，導(dǎo)致印跡膜被破壞。因此選擇3∶1 的甲醇/乙酸作為洗脫劑。

將傳感器置于3∶1 的甲醇/乙酸中磁力攪拌洗脫后用水沖洗，再進(jìn)行CV 掃描，結(jié)果表明，隨著攪拌時(shí)間的增加，CV 峰電流不斷升高。這是因?yàn)橛≯E膜中的甲霜靈不斷被溶出，印跡孔穴增多，使到達(dá)電極表面的鐵氰化鉀探針增多。當(dāng)洗脫時(shí)間超過(guò)20 min 后，CV 峰電流不再增加，說(shuō)明印跡膜中的模板被全部去除。因此確定洗脫時(shí)間為20 min。

2.4 吸附時(shí)間的選擇

考察了甲霜靈在印跡膜上的吸附時(shí)間對(duì)電極響應(yīng)的影響。將傳感器浸入8×10-6mol/L 甲霜靈待測(cè)液中，每隔20 s 用靈敏度較高的差示脈沖法掃描。結(jié)果表明，隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，電極響應(yīng)值不斷升高，當(dāng)吸附時(shí)間為2 min 時(shí)響應(yīng)值最高，說(shuō)明印跡膜中甲霜靈印跡孔穴吸附趨于飽和。因此確定吸附時(shí)間為2 min。

2.5 傳感器的性能研究

2.5.1 線(xiàn)性方程和檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，考察印跡電極在鐵氰化鉀緩沖液中對(duì)不同濃度甲霜靈的DPV 響應(yīng)曲線(xiàn)。結(jié)果（圖7）表明，鐵氰化鉀峰電流隨甲霜靈濃度的增加而逐漸降低，其峰電流的響應(yīng)值Δip（鐵氰化鉀緩沖液中不含甲霜靈和含有甲霜靈時(shí)的峰電流之差與甲霜靈濃度c 在3.0×10-9～1.8×10-5mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Δip=1.141 6+0.407c（R2= 0.996 8）。計(jì)算20 次空白實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，以3Sb/k 為檢出限（LOD），其中k 為

圖7 甲霜靈印跡傳感器在鐵氰化鉀緩沖液中對(duì)不同濃度甲霜靈的響應(yīng)Fig.7 Response of metalaxyl imprinted sensor to metalaxyl at different concentrations in potassium ferricyanide buffer solution

工作曲線(xiàn)的斜率，則甲霜靈的檢出限為1.01×10-9mol/L，經(jīng)1.2.6 節(jié)公式（1）換算后為0.003 mg/kg。

采用相同的聚合方法在裸玻碳表面制備了甲霜靈印跡膜電極，并研究了此電極測(cè)定甲霜靈的線(xiàn)性范圍和檢出限。響應(yīng)電流Δi 與甲霜靈的 濃 度c 在6.0×10-8～3.8×10-6mol/L 范 圍 內(nèi) 具 有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為Δi=1.4+0.349c（R2=0.994 7），檢出限為3.1×10-8mol/L（0.086 mg/kg）。綜上可知，鄰苯三酚的引入顯著增加了傳感器的靈敏度。

2.5.2 傳感器的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性分子印跡膜對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別是印跡傳感器的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)于基質(zhì)成分很復(fù)雜的煙草樣品來(lái)說(shuō)有非常重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在鐵氰化鉀緩沖液中測(cè)定了傳感器對(duì)8.0×10-6mol/L甲霜靈的DPV 響應(yīng)，以及含有可能會(huì)對(duì)煙草中甲霜靈測(cè)定產(chǎn)生影響的烯酰嗎啉、氟嗎啉、苯霜靈，空白煙草提取液、樂(lè)果和百菌清時(shí)的DPV 響應(yīng)。由圖8 可知，空白煙草提取液對(duì)測(cè)定有一定的干擾，但由于電流響應(yīng)值超出該方法線(xiàn)性范圍，因此可忽略不計(jì)。另外，10 倍濃度于甲霜靈的烯酰嗎啉、氟嗎啉和苯霜靈，50 倍濃度于甲霜靈的樂(lè)果和百菌清并未干擾甲霜靈的測(cè)定結(jié)果，說(shuō)明印跡孔穴對(duì)甲霜靈的選擇性較好。

圖8 干擾物質(zhì)對(duì)甲霜靈測(cè)定的影響Fig.8 Effect of interference material on determination of metalaxyl

用相同方法制備的5 支電極對(duì)相同濃度的甲霜靈進(jìn)行測(cè)定，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.12%；

2.6 實(shí)際樣品分析

將4 個(gè)煙草樣品用該實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行甲霜靈的檢測(cè)，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果（表1）表明，電化學(xué)分析法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.98%～4.26%，加標(biāo)回收率為98.5%～113.7%，初步說(shuō)明測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

為進(jìn)一步驗(yàn)證此傳感器的測(cè)定結(jié)果，采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法LC-MS/MS 法測(cè)定4 個(gè)煙草樣品中的甲霜靈，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)T 檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)，P值＞0.05，說(shuō)明在95%置信度下，兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異?？梢?jiàn)，本方法與LC-MS/MS 法的一致性較好。

表1 煙草樣品中甲霜靈的測(cè)定結(jié)果（n=5）Tab.1 Determination results of metalaxyl in tobacco samples（n=5）

表2 本方法與液相串聯(lián)質(zhì)譜法的比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab.2 Results of comparison experiment between this method and LC-MS/MS（n=5） (mg·kg-1)

3 結(jié)論

以甲霜靈為模板，苯酚為功能單體，在聚鄰苯三酚修飾的玻碳電極表面成功制備了一種能簡(jiǎn)單快速靈敏準(zhǔn)確檢測(cè)煙草農(nóng)殘甲霜靈的分子印跡傳感器。本方法克服了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中儀器昂貴、分析時(shí)間長(zhǎng)、樣品前處理較為繁瑣等不足，定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。方法的檢出限為0.003 mg/kg，加標(biāo)回收率為98.5%～113.7%，RSD 為2.98%～4.26%。本方法應(yīng)用簡(jiǎn)單、測(cè)定快速、結(jié)果準(zhǔn)確、選擇性強(qiáng)、靈敏度高，適用于煙草農(nóng)殘甲霜靈的檢測(cè)。