中藥單體環(huán)黃芪醇的制備方法＊

楚治良，王好鋒，韓 靜，王曉娜，龔 慧，高春芳

黃芪甲苷（astragaloside IV）是中藥黃芪發(fā)揮藥理活性的主要成分。研究表明，黃芪甲苷具有很好的保肝［1］、降血糖［2］、抗腫瘤［3］等生物活性。黃芪甲苷雖然有很好的生物活性，但由于它相對分子質(zhì)量和空間位阻較大，使其脂溶性和水溶性均較低，所以不利于機(jī)體的吸收和制劑的開發(fā)［4］。有報道稱，黃芪甲苷在機(jī)體內(nèi)可以經(jīng)腸道菌群降解為環(huán)黃芪醇后被吸收利用［5］。環(huán)黃芪醇是黃芪甲苷的苷元，在自然界主要存在于黃芪中，屬于環(huán)菠蘿烷型四環(huán)三萜類化合物［6］（二者結(jié)構(gòu)見圖1）。由于相對分子質(zhì)量較小，使其相對黃芪甲苷而言具有更好的脂溶性，更容易透過細(xì)胞膜而被機(jī)體吸收［7］。目前研究表明，環(huán)黃芪醇可以提高端粒酶活性從而提高CD3和CD8 T細(xì)胞的增殖能力來抑制細(xì)胞的衰老［8］，同時環(huán)黃芪醇展現(xiàn)出了它抗病毒的活性，因為T細(xì)胞增殖能力的加強(qiáng)，更有利于減少HIV病毒的產(chǎn)生［9］。

環(huán)黃芪醇在中藥黃芪中含量很低，主要由黃芪甲苷制得。目前報道的方法主要有酶解法［10］、Smith降解法［11-13］、酸水解法［14，15］。 其中酶解法工藝簡單，但對反應(yīng)條件要求比較苛刻，并且酶的價格昂貴，不利于應(yīng)用性推廣。Smith降解法條件溫和并且收率較高，但需要氧化→還原→水解→萃取→純化五步完成［16］，步驟繁瑣，成本較高。直接酸水解法操作簡單，成本較低，但由于環(huán)黃芪醇在劇烈的酸性條件下極易轉(zhuǎn)化為黃芪醇［13，17］（結(jié)構(gòu)見圖 1），所以在劇烈的條件下，直接采用酸水解法，收率較低。筆者以黃芪甲苷為原料，采用溫和的雙相酸水解法制得環(huán)黃芪醇，并利用正交試驗設(shè)計法對有機(jī)相溶劑、反應(yīng)時間、水溶液中甲醇和鹽酸的體積分?jǐn)?shù)4個因素進(jìn)行優(yōu)化，以獲得條件溫和、操作簡單、成本低、收率較高的環(huán)黃芪醇制備方法，最終為環(huán)黃芪醇的進(jìn)一步研究提供科學(xué)資料。

圖 1 環(huán)黃芪醇（cycloastragenol）、黃芪甲苷（Astragaloside IV）和黃芪醇（Astragenol）

1 材料與方法

1.1 儀器與材料電子天平 （梅特勒托利多，AB-265-S）， 旋蒸儀 （德國 IKA 公司，RV10型），Waters E2695型高效液相 （Empower2色譜工作站,Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測器），黃芪甲苷（南京春秋生物工程有限公司，批號：HQJG20170921，HPLC≥98%），環(huán)黃芪醇 （南京春秋生物工程有限公司，批號：HHQC20170921，HPLC≥98%），苯（麥克林生化科技有限公司，分析純），三氯甲烷（上海化學(xué)試劑公司，分析純），甲苯（成都市金山化工試劑廠，分析純），甲醇（洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司，分析純），鹽酸（開封市芳晶化學(xué)試劑有限公司，分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1原理 苷類化合物，在鹽酸或硫酸的稀醇溶液中，可以水解生成苷元。如果苷元不穩(wěn)定，直接酸水解法會使苷元產(chǎn)生異構(gòu)化、脫水等反應(yīng)，最終得不到真正的苷元。黃芪甲苷在劇烈的酸性條件最終主要產(chǎn)物是黃芪醇，而不是苷元環(huán)黃芪醇［13，17］。 因此采用雙相酸水解法，一相為酸水相，一相為與酸水不互溶的有機(jī)相，根據(jù)苷元環(huán)黃芪醇易溶于親脂性有機(jī)溶劑，而不易溶于水的性質(zhì)，即在酸水解過程中，稀鹽酸可將黃芪甲苷水解為環(huán)黃芪醇，游離出來的環(huán)黃芪醇隨即溶于有機(jī)溶劑，使環(huán)黃芪醇不被酸水相破壞，從而提高反應(yīng)收率。

1.2.2方法 包括：（1）雙相酸水解法。準(zhǔn)確稱量100 mg的黃芪甲苷置于500 ml圓底燒瓶中，加入100 ml含一定濃度的鹽酸和甲醇的水溶液，160 ml的有機(jī)相溶劑。在室溫條件下劇烈攪拌一定時間后靜置，收集有機(jī)相，取適量的碳酸氫鈉水溶液中和酸水相，再加入等體積的三氯甲烷萃取。合并有機(jī)相，并用飽和氯化鈉水溶液清洗兩次，再用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，減壓濃縮，得白色固體。殘留物用甲醇溶解并定容到10 ml，測定環(huán)黃芪醇并計算收率。其中，當(dāng)筆者將100 mg的黃芪甲苷置于500 ml圓底燒瓶中，加入100 ml含有18%鹽酸的20%甲醇水溶液（v/v），然后再加入三氯甲烷160 ml，在室溫條件下劇烈攪拌6 d時，環(huán)黃芪醇收率最高為46.27%。（2）正交試驗設(shè)計優(yōu)化反應(yīng)條件。在室溫條件下，利用正交試驗設(shè)計對雙相酸水解的有機(jī)相（A）、甲醇濃度（B）、反應(yīng)時間（C）和鹽酸濃度（D） 4個因素進(jìn)行優(yōu)化。（3）色譜條件。色譜柱：XBridge C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（40∶60）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；漂移管溫度：60 ℃；進(jìn)樣量：5～10 μl；氮?dú)鈮毫Γ?5.0 psi；分析時間：16min。（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。精密稱量環(huán)黃芪醇7.91 mg，加甲醇定容于10 ml容量瓶中，作為對照品溶液。 精密吸取對照溶液 3 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量的對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積的對數(shù)（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（5）供試品溶液的配制。精密稱量濃縮后所得的環(huán)黃芪醇粗品10 mg，加甲醇定容于10 ml容量瓶中，即得。（6）收率計算。將雙相酸水解法制備的樣品用HPLC進(jìn)行分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中環(huán)黃芪醇的質(zhì)量濃度，并計算收率（Z）。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線環(huán)黃芪醇的線性回歸方程為：Y=1.1043X+4.8684（r=0.9999）；環(huán)黃芪醇質(zhì)量在 2.73～15.82 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 雙相酸水解條件的優(yōu)化按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗，試驗結(jié)果顯示（表1），試驗中所考察的四個因素對環(huán)黃芪醇收率影響的大小順序是A＞B＞C＞D，即有機(jī)相＞甲醇體積分?jǐn)?shù)＞反應(yīng)時間＞鹽酸體積分?jǐn)?shù)；最佳的反應(yīng)條件為A1B3C3D3，即在室溫條件下，有機(jī)相為三氯甲烷、甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%、鹽酸體積分?jǐn)?shù)為18%、反應(yīng)時間為6 d時，環(huán)黃芪醇收率最高。根據(jù)正交試驗方差分析顯示（表2），與因素B和C進(jìn)行對比，因素A具有顯著的影響（P=0.041）。

表 1 雙相酸水解法正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表 2 雙相酸水解的正交試驗方差分析

3 討論

在傳統(tǒng)的直接酸水解法制備環(huán)黃芪醇過程中，由于環(huán)黃芪醇在劇烈的酸性條件下極易轉(zhuǎn)化為黃芪醇，所以直接采用酸水解法制備環(huán)黃芪醇目標(biāo)產(chǎn)物收率較低。該試驗采用雙相酸水解法，避免了環(huán)黃芪醇在劇烈酸性條件下裂解為黃芪醇的不良反應(yīng)，有效保護(hù)了環(huán)黃芪醇的穩(wěn)定性，從而提高了收率。

該反應(yīng)在室溫條件下進(jìn)行，條件溫和，可以有效地以黃芪甲苷為原料制備環(huán)黃芪醇，反應(yīng)無需加熱、回流，工藝簡單，有利于環(huán)黃芪醇的生產(chǎn)。

該試驗利用正交試驗設(shè)計法，對雙相酸水解制備環(huán)黃芪醇的方法做了初步的研究，結(jié)果表明：有機(jī)相的種類對環(huán)黃芪醇的收率影響較大，最終確定在室溫條件下，有機(jī)相為三氯甲烷、甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%、鹽酸體積分?jǐn)?shù)為18%、反應(yīng)時間為6 d時，用黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的效果最佳，但放大和工業(yè)化等方面仍需要進(jìn)一步的研究。