細胞（蠟）塊聯(lián)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)通過胸腔積液檢測診斷惡性腫瘤的價值

王占東，卓 靜，李 菲，繆曉丹，王 濤，時 瑤

胸腔積液是晚期惡性腫瘤患者常見的臨床并發(fā)癥狀，臨床多采用穿刺抽取積液以減輕癥狀，并進行常規(guī)細胞學(xué)檢查。大多數(shù)病例會得到明確診斷，但對于原發(fā)灶不明、無法通過內(nèi)鏡活檢、體外穿刺及手術(shù)切除獲得組織標本的病例，胸腔積液細胞病理學(xué)診斷可能是這類患者能確診的選擇方法。傳統(tǒng)涂片明顯不能滿足要求，臨床迫切需要從胸腔積液獲得明確診斷，采取精準治療，因此胸腔積液進行細胞蠟塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測應(yīng)運而生，并迅速發(fā)展，筆者收集近兩年的病例，進行回顧性總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年1月—2018年12月徐州市腫瘤醫(yī)院收治的406例胸腔積液患者作為觀察對象，所有患者均經(jīng)過該院影像學(xué)診斷、穿刺確診為胸腔積液患者；所有患者均進行傳統(tǒng)涂片細胞學(xué)檢查，其中陰性161例、僅見少許異型細胞38例，高度可疑癌36例，發(fā)現(xiàn)癌細胞164例，其他惡性腫瘤7例。其中56例診斷不明確或已診斷為癌而臨床需要進一步分型的患者，進行細胞蠟塊及免疫細胞化學(xué)技術(shù)檢測。

1.2方法

1.2.1傳統(tǒng)涂片制作方法 采集患者漿膜腔積液標本 200～500 ml，迅速送往細胞室。 取出 20 ml，置離心管中，2000 r/min，離心10 min，棄去上清，取出沉渣，采用推拉法制片2張/例，待其自然風干之后，使用瑞特-吉姆薩雙染色法進行染色處理。

1.2.2細胞塊制作方法 把剩余的漿膜腔積液，靜止后，棄上清，留存50 ml，震蕩后移入離心管內(nèi)，2000 r/min，離心10 min離心兩次后離心管中加入10%中性甲醛10 ml，室溫固定處理1 h后，棄上清，使用吸管將細胞塊放置于顯微鏡擦鏡紙上，包好后放入包埋盒，置于自動脫水機中進行處理，做成石蠟細胞塊。進行常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅染色，光鏡觀察。

1.2.3免疫細胞化學(xué)采用En Vision法 一抗雌激素受體廣譜細胞角蛋白 （pan-cytokeratin，CKpan）、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF-1、NapsinA、Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。陽性判斷標準：相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒。操作步驟均按說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，率采用（%）表示，比較用 χ2檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

56例胸腔積液患者，男18例，女38例；年齡25～86歲，中位年齡69歲。傳統(tǒng)涂片法查見癌細胞，即陽性37例；未查見癌細胞，即陰性5例；查見異型或可疑癌細胞，即不確定14例。胸腔積液細胞蠟塊結(jié)合免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，陽性47例（包括轉(zhuǎn)移性肺腺癌43例，鱗狀細胞癌2例，乳腺癌1例，卵巢漿液性癌1例），陰性9例。其中2例傳統(tǒng)涂片診斷為癌，而細胞塊加免疫細胞化學(xué)證實為增生的間皮細胞，14例不確定者，其中9例證實為癌，5例為陰性。后者陽性檢出率高于前者，且不確定構(gòu)成比低于前者（表1）。兩種方法檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.556，P＜0.05），見表 2。

細胞塊石蠟切片中轉(zhuǎn)移性肺腺癌細胞常常成團聚集，邊緣光滑的三維立體的細胞球最常見，也可以呈梅花狀、乳頭狀和腺腔，核漿比增大，核異型，核染色質(zhì)細膩（圖1），背景可見少許炎細胞，使癌細胞非常突出，或背景夾雜大量增生間皮細胞，與癌細胞不易區(qū)別（圖2）。造成形態(tài)學(xué)診斷困難。

表 1 傳統(tǒng)涂片與細胞塊+免疫細胞化學(xué)檢出率比較［例（%）］

表 2 兩種方法檢出率與漏檢率比較［例（%）］

免疫細胞化學(xué)染色：轉(zhuǎn)移性癌表達廣譜細胞角蛋白（pan-cytokeratin，CKpan）、BerEP4，同時轉(zhuǎn)移性肺腺癌細胞 TTF-1（圖 3）、NapsinA（圖 4）陽性；鱗狀細胞癌 CK5/6、P40陽性；乳腺癌 ER、PR及GATA3 陽性；卵巢癌 WT-1、PAX8、CA125 陽性。而增生的間皮細胞表達 CK5/6、Calretin、WT-1等抗體。

圖1～4見封三。

3 討論

胸腔積液是臨床常見病癥，其良惡性判定對疾病的診斷、治療及預(yù)后有重要的臨床意義。如何利用胸腔積液判斷是炎癥反應(yīng)、間皮增生、間皮瘤、還是轉(zhuǎn)移性腫瘤，是臨床關(guān)心的問題，如果能同時判斷轉(zhuǎn)移性腫瘤的來源及類型，亦是臨床診斷及治療的需要。胸腔積液離心后制成細胞涂片，進行細胞學(xué)診斷是最常用的方法，已開展多年，也解決了很多實際問題，但尚不能滿足需要，免疫組織化學(xué)是外科組織病理學(xué)最常用的診斷技術(shù)，其結(jié)果有助于確診腫瘤的良惡性、組織來源及組織亞型。如何把免疫組織化學(xué)應(yīng)用于細胞學(xué)，現(xiàn)在有多種方法，其一是細胞涂片退染后，免疫細胞化學(xué)染色；其二采用同時制備多張涂片進行免疫細胞化學(xué)染色的方式；還有一種就是現(xiàn)在逐漸被認可并用于實際工作的細胞塊加免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法［1-3］。

細胞塊（cell block，CB）制備是指將細胞懸浮液離心，得到高度濃縮的細胞和微小的組織塊，再經(jīng)由固定、脫水、透蠟和石蠟包埋等操作后得到的可長期保存的細胞蠟塊?，F(xiàn)在常見的細胞塊制備方法主要有直接法（離心管沉淀制備法、冷凍細胞團蠟塊制備法、試管包埋法、載玻片細胞聚集制備法）和間接法（瓊脂細胞塊制備法、蛋清細胞塊制備法、凝血酶一血漿細胞塊制備法、HistoGel制備法、Collodion bag（ColB）制備法）［4］，筆者采用了最簡單直接的離心沉淀法，富集有核細胞層制備細胞塊，具有細胞數(shù)量較多，背景清晰，染色鮮艷，核漿對比清晰，組織結(jié)構(gòu)也保存得比較完整等優(yōu)點［5］。同時細胞塊易于保存，可連續(xù)切片，便于進行免疫細胞化學(xué)染色，其免疫細胞化學(xué)染色背景清晰，著色均勻，陽性定位準確，顯色明確，資料可長期保存，使細胞學(xué)具有組織病理學(xué)的特點［6］。如有需要還可以進行基因檢測［7］。

胸腔積液需要確定是炎癥反應(yīng)，間皮瘤，還是轉(zhuǎn)移性腫瘤，因此需要一組標志物，進行鑒別診斷，常 用 的 是 CK （pan）、CK5/6、P63、GATA3、Cg-A、Synaptophysin、TTF -1、NapsinA、Calretin、WT -1、MOC-31、BerEP4、Ki-67等多種抗體標志。對于胸腔積液中常見的轉(zhuǎn)移性肺腺癌CK （pan）、TTF-1、NapsinA 是常用的標志物［8］，鱗狀細胞癌 CK5/6、P40陽性；乳腺癌ER、PR及GATA3陽性；卵巢癌WT-1、PAX8、CA125陽性。而增生的間皮細胞表達CK5/6、Calretin、WT-1 等 抗 體 。 其 中 WT-1（Wilm’s tumor gene）在增生間皮細胞、間皮瘤及轉(zhuǎn)移性卵巢漿液性癌中呈核陽性，轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤胞漿陽性。而組織細胞、淋巴細胞、轉(zhuǎn)移性肺腺癌、乳腺癌、胃癌等呈陰性［9］。CK（pan）在間皮與癌細胞均有表達，需要 Calretin、WT-1、MOC-31、BerEP4 等多種抗體聯(lián)合應(yīng)用，才能鑒別診斷。該組病例，未見報道中的惡性黑色素瘤，淋巴瘤，如有需要，應(yīng)用于組織蠟塊的免疫細胞化學(xué)抗體，在細胞塊中也適用。

該實驗結(jié)果顯示，細胞塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法對于胸腔積液的陽性檢出率明顯高于傳統(tǒng)涂片，且對于轉(zhuǎn)移癌能進一步明確來源及類型，細胞塊具有可長期保存的優(yōu)勢，因此細胞塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法對于提高細胞學(xué)診斷準確性有很大幫助，應(yīng)用于宮頸及非婦科液基細胞學(xué)的細胞塊結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)方法已有報道［10］，不斷總結(jié)經(jīng)驗，提高細胞學(xué)診斷水平。