血清miR-25與胃癌病理診斷和預(yù)后的相關(guān)性研究

畢書祝，楊 越，牛 平，王 梅

胃癌預(yù)后判斷主要根據(jù)患者的臨床數(shù)據(jù)和病理分期確定［1］，但臨床缺乏能夠預(yù)測預(yù)后和轉(zhuǎn)移的高度敏感和特異性的生物標(biāo)志物，這使胃癌患者的早期診斷成為難點(diǎn)。miRNA是一種小的非編碼RNA分子，可調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)，并在各種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［2，3］。 miRNA 在許多惡性腫瘤中失調(diào)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4-8］。 研究發(fā)現(xiàn)，miR-25在人 GC細(xì)胞系，組織和血清/血漿樣品中過度表達(dá)［9，10］，該研究旨在檢測血清miR-25在胃癌患者中的表達(dá)水平，探討miR-25作為胃癌患者診斷和預(yù)后標(biāo)志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料青島大學(xué)附屬醫(yī)院的184名胃癌患者作為研究對象。所有患者在2006年4月—2010年1月10日接受胃癌根治性切除，并行內(nèi)鏡診斷和活檢。術(shù)前化療患者未納入研究。黃島區(qū)人民醫(yī)院的78名健康人員和56例胃炎患者作無癌對照。

1.2 方法（1）RNA提取。診斷或手術(shù)前以及健康志愿者中取外周血（7 ml），提取血漿并將血漿儲存在-80℃。然后按照常規(guī)生化方法提取總RNA。儲存于-80℃冰箱中用于后續(xù)實驗。（2）qRT-PCR分析。根據(jù)制造商的手冊（Biomics，Jiangsu Nantong）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR，使用U6 siRNA作為內(nèi)部對照。25 μl qRT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)含有3 μl總RNA提取物、miR-25和U6特異性引物、正向和反向引物以及2x主混合物。PCR條件包括在42℃下反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃變性 10 min；40個循環(huán)的 95℃變性20 s，60℃退火 30 s，72℃伸長 30 s。在 72℃下收集熒光信號。使用ΔCt=CtmiR-25-CtU6分析數(shù)據(jù)。2-ΔCt代表患者血漿中的相對miR-25表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22統(tǒng)計軟件包進(jìn)行所有統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均表示為x±s，非配對t檢驗或Mann-Whitney檢驗用于分析受試者和對照之間的差異或miR-25水平的平均值與患者臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。ROC曲線和ROC曲線下面積（AUC）值用于評估m(xù)iR-25水平作為GC診斷的可行性；使用Cox進(jìn)行單變量和多變量生存分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般特征檢測了184例胃癌患者的血清miR-25水平并與78名健康對照者和56例胃炎患者的miR-25水平相比較。胃癌患者的中位年齡為63.6歲（33～81歲），78名健康者中位年齡為62.8歲（32～80歲），76例胃炎患者中位年齡為62.7歲（34～79），胃癌組與其他兩組的患者年齡相比無顯著差異（P＞0.05）。胃癌患者男性和女性的數(shù)量分別為112例（60.9%）和72例（39.1%），健康對照組分別為44例（56.4%）和34例（43.6%），胃炎患者分別為42例（53.8%）和36例（46.2%），性別之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 血清miR-25水平與胃癌患者臨床病理特性的關(guān)系健康對照組患者的血清miR-25水平為（0.012±0.008），胃炎患者為（0.014±0.010），胃癌患者為（0.063±0.040）。胃癌患者血清miR-25表達(dá)顯著高于健康對照組（P=0.006）和胃炎組（P=0.006），健康對照組和胃炎組的血清miR-25濃度無明顯差異（P=0.742）。高血清濃度的miR-25與胃癌的T分期（P=0.026）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.002）和疾病分期（P=0.003）呈正相關(guān)（均 P＜0.001）。 見表 1。

2.3 血清miR-25水平升高與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)Kaplan-Meier分析血清miR-25與總體存活率之間的關(guān)系。血清miR-25的cutoff值為0.042，65%（120/184）GC 患者血清 miR-25水平升高，35%（64/106）血清miR-25水平降低。低血清miR-25水平胃癌患者的存活率明顯升高（圖1a，P=0.0028）。為了進(jìn)一步評估血清miR-25在不同TNM分期患者中的診斷準(zhǔn)確率，筆者將患者分為早期（Ⅰ～Ⅱ）和晚期（Ⅲ～Ⅳ）組。在TNM的Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ亞組中，血清miR-25水平能準(zhǔn)確性預(yù)測TNMⅠ和Ⅱ分期，以及TNMⅢ和Ⅳ分期（圖1b～1c）。單變量Cox分析發(fā)現(xiàn)：腫瘤大小、血管侵犯、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期和血清miR-25是胃癌患者的危險因素（表2）。多變量Cox分析將腫瘤大小、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血清miR-25鑒定為胃癌的獨(dú)立危險因素 （表2）。這些數(shù)據(jù)表明高血清miR-25是預(yù)測胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。

表 1 血清 miR-25水平與胃癌患者臨床病理特性的關(guān)系

2.4 血清miR-25水平對胃癌患者的診斷價值ROC曲線分析血清miR-25的診斷價值：根據(jù)血清miR-25的表達(dá)水平可以鑒別胃癌患者與對照組的健康人員及胃癌患者。血清miR-25區(qū)分胃癌患者和健康對照組敏感性為69.4%，特異性為84.6%（P＜0.0001，［CI］：0.662-0.817）（圖 2）；此外，miR-25 區(qū)分GC患者和胃炎對照組的敏感性為67.3%，特異性為 80.4%，最佳臨界點(diǎn)的 AUC為 0.732（P＜0.0001，［CI］：0.653-0.794）（圖 2）。

3 討論

由于胃癌缺乏高敏感性和非侵入性的診斷標(biāo)志物，對其早期診斷帶來困難，也是造成胃癌患者預(yù)后不良的重要原因。miRNA可以通過分泌外泌體顆粒從癌細(xì)胞釋放到體液中，保護(hù)它們免受RNase在循環(huán)中的降解［11］。在血清、血漿、尿液、淚液、羊水和胃液中可檢測到多種循環(huán) miRNA［12，13］。 體液中循環(huán)的miRNA不同表達(dá)方式與某些病理狀態(tài)下的不同細(xì)胞類型有關(guān)［14］。因此，miRNA可能是胃癌診斷的非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，血清中循環(huán)miRNA的表達(dá)水平與腫瘤組織中的表達(dá)水平相一致，它們可以作為腫瘤檢測的生物標(biāo)志物［13］。

最近發(fā)現(xiàn)，在病理生理條件下，miR-25是一種致癌的miRNA。它在許多腫瘤類型的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，包括腦腫瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌和肝細(xì)胞癌等［15］。臨床研究還發(fā)現(xiàn)：miR-25在胃癌Ⅰ～Ⅲ期患者的組織和（或）血漿/血清樣品中升高［16］。在我們的研究中，胃癌患者的血清miR-25濃度增加，并且高血清濃度的miR-25與胃癌的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病分期呈正相關(guān)。而miR-25的血清表達(dá)水平與其他臨床病理學(xué)指標(biāo)之間沒有相關(guān)性。預(yù)后分析顯示，血清濃度高的miR-25患者的生存率低于血清miR-25濃度低的患者。根據(jù)多變量分析的結(jié)果，miR-25的血清濃度是胃癌患者中OS和RFS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。該研究結(jié)果表明，胃癌患者miR-25的血清濃度可作為胃癌可行的預(yù)后生物標(biāo)志物。ROC曲線分析還證實，血清miR-25水平有助于區(qū)分PC患者與健康對照者和胃炎患者的敏感性和特異性指標(biāo)。因此，血清miR-25水平可能是胃癌的診斷標(biāo)志物，但其敏感性和特異性仍然相對較低。如果血清miR-25結(jié)合 sCEA，CA19-9，CA72-4，CA125和甲胎蛋白等其他胃癌血清標(biāo)志物，則可提高胃癌的診斷率。雖然血清miR-25具有較低的敏感性和特異性，但在判斷腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后方面具有很大優(yōu)勢，對指導(dǎo)晚期胃癌的治療具有重要意義。