高脂飲食誘導(dǎo)青春期前雌性大鼠多囊卵巢綜合征的實驗研究

古蘭·托合提木拉提，葉爾努爾·吐蘇甫汗，馬玉蘭，瑪依努爾·尼亞孜

（1.新疆自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 新疆 烏魯木齊 830028）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome,PCOS）是女性不育不孕的主要病因之一[1]。為研究PCOS 病因及其發(fā)病機制，目前已經(jīng)復(fù)制了多種PCOS動物模型，但這些模型均未能全面反映PCOS 患者常見的卵巢形態(tài)、功能及代謝特征變化[2-4]。本研究擬探討高脂飲食（high-fat diet,HFD）對青春期前大鼠卵巢形態(tài)、功能、胰島素敏感性和激素水平的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雌性大鼠18 只，8 ～10 周齡，體重200 ～250 g；SPF 級SD 雌性大鼠18只，3 ～4 周齡，體重45 ～55 g，均購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SYXK（新）2013-0002]。飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h 晝夜交替，清潔飼養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境安靜，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF 要求。

1.2 試劑與儀器

普通顆粒飼料（100%基礎(chǔ)飼料，含65%碳水化合物、21.5%蛋白質(zhì)、4%脂肪及9.5%其他）和高脂肪飼料（50%基礎(chǔ)飼料、17%豬油、19%豆油、6%蔗糖、6%酪蛋白及2%其他，含36%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、40%脂肪及4%其他）購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。來曲唑購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司（批號：15011956，國藥準(zhǔn)字H19991001），羧甲基纖維素鈉購自美國Sigma 公司（批號1002004856），Trizol 試劑購自美國英杰生命技術(shù)有限公司，ACS-1.51A 電子秤購自上海友聲衡器有限公司，XS205 分析天平購自瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，血糖儀購自德國羅氏診斷有限公司，全自動生化分析儀購自美國Beckman 公司，ABI-7900 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI Biosystem 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型復(fù)制 PCOS 陽性對照：將8 ～10 周齡SD 大鼠隨機分為A組和B組，各9 例。A組作為B組的對照，A組和B組采用普通顆粒飼料喂養(yǎng)21 d，A組每日同時灌胃1%羧甲基纖維素（LET溶解劑），B組每日同時灌胃1%羧甲基纖維素+來曲唑[1 mg/（kg·d）][5]。

PCOS 實驗對照：將3 ～4 周齡SD 大鼠隨機分為C組和D組，各9 例。C組為D組的對照，采用普通顆粒飼料連續(xù)喂養(yǎng)105 d；D組則采用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)105 d[6]。

1.3.2 大鼠體重及動情周期監(jiān)測 每日稱4組大鼠體重并記錄。A組和B組于第14 ～21 天，C組和D組于第42 ～49 天、第70 ～77 天及第98 ～105 天每只大鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，用生理鹽水（0.9%氯化鈉NaCl）清洗陰道，收集陰道壁上的細(xì)胞并涂抹在玻片上。在顯微鏡下檢查玻片上的有核上皮細(xì)胞、角化上皮細(xì)胞和白細(xì)胞的相對豐度，觀察大鼠動情周期 變化。

1.3.3 糖耐量試驗、胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR）及胰島素敏感檢測指數(shù) ①糖耐量試驗：禁食過夜后，次日空腹采尾靜脈血，測定空腹血糖（fasting blood glucose,FBG），隨后以葡萄糖2 g/kg 灌胃大鼠，在0、30、60 和120 min 后通過尾靜脈取血，測定血糖值。采用Med Calc 11.4.1.0 統(tǒng)計軟件分析曲線下面積（area under the curve,AUC）[7]。②HOMA-IR：采用放射免疫法檢測空腹胰島素（fasting insulin,FINS），HOMAIR=FINS×FBG/22.5。③定量胰島素敏感性檢測指 數(shù)=1/[log（FBG）+log（FINS）][7]。

1.3.4 血清血脂及性激素檢測 禁食過夜后，次日空腹采尾靜脈血檢測血清總膽固醇（total cholesterol,TC）和甘油三酯（Triglycerides,TG）。采用放射免疫法測定促黃體生成激素（Luteinizing hormone,LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）、雌二醇（Estradiol,E2）、孕酮（Progesterone,P）及睪酮（Testosterone,T）。

1.3.5 LH 受體（luteinizing hormone receptor,LHR）及FSH受體（follicle stimulating hormone receptor,FSHR） mRNA 表達(dá)處死大鼠并分離卵巢。采用Trizol 試劑提取卵巢細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用實時熒光定量PCR反應(yīng)檢測LHR和FSHR mRNA表達(dá)。LHR正向引物：5’-TCCGTGGACTCCCAAACA-3’，反向引物：5’-ATCGTGGCGATCAGCGTA-3’。FSHR 正向引物：5’-ACTGTGCATTCAACGGAA-3’，反向引物：5’-GCCTCCATGAGGGTGACA-3’。β-actin正向引物：5’-CTGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3’，反向引物：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAGCCT-3’。以2-△△Ct法計算。

1.3.6 卵巢重量及組織學(xué)檢查 A組和B組于第21天，C組和D組于第105 天，處死大鼠并分離卵巢，稱取卵巢重量后，以卵巢最大平面作為待檢面，將其包埋在石蠟中，切成4 ～5μm 厚的切片，用蘇木精-伊紅染色后觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph pad Prism 6 和Med Calc 11.4.1.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用配對t檢驗或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體重增長情況

A組和B組0、7、14 及21 d 體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=201.542，P=0.000）；②兩組體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.863，P=0.000），B組低于A組；③兩組體重變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.021，P=0.000）。見表1和圖1A。

C組 和D組0、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、98 及105 d 體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=30.560，P=0.000）；②兩組體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.432，P=0.051）；③兩組體重變化趨勢比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.739，P=0.744）。見表2和圖1B。

表1 A、B組不同時間點體重比較 （n =9，g，±s）

表1 A、B組不同時間點體重比較 （n =9，g，±s）

組別 0 d 7 d 14 d 21 d A組 219.43±6.21 235.76±7.87 252.13±8.34 261.65±8.65 B組 211.21±6.87 242.23±8.35 261.41±9.81 288.53±7.62

表2 C、D組不同時間點體重比較 （n =9，g，±s）

表2 C、D組不同時間點體重比較 （n =9，g，±s）

組別 0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49 d C組 51.03±4.21 58.43±6.32 77.54±7.65 122.33±8.39 137.41±7.43 151.21±8.86 168.48±6.54 181.43±8.27 D組 52.23±5.42 62.34±6.14 80.12±8.41 118.3±7.54 144.44±7.21 156.45±8.42 172.32±7.61 183.95±8.63組別 56 d 63 d 70 d 77 d 84 d 91 d 98 d 105 d C組 194.54±9.65 201.32±7.52 210.53±8.45 218.01±8.01 220.43±7.98 225.54±7.34 234.53±8.32 245.43±8.63 D組 196.19±8.18 209.71±8.76 212.43±9.87 219.21±7.42 225.81±7.65 234.32±8.87 245.36±8.42 252.32±7.51

2.2 各組動情周期變化

陰道涂片評估動情周期發(fā)現(xiàn)，A、C組動情周期規(guī)律，均為4 ～5 d。B組在第14 ～21 天陰道涂片僅觀察到白細(xì)胞，提示B組失去了規(guī)律的動情周期。D組第42 ～49、70 ～77 及98 ～105 天發(fā)情周期持續(xù)時間逐漸延長，表明發(fā)情周期不規(guī)律。

2.3 各組卵巢重量和卵巢組織形態(tài)學(xué)比較

A組觀察結(jié)束后卵巢重量為（54.26±4.51）mg，B組為（70.91±5.23）mg，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.233，P=0.000），B組高于A組。

C組觀察結(jié)束后卵巢重量為（41.84±5.98）mg，D組為（46.62±5.32）mg，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.792，P=0.092）。

B組和D組均觀察到多個囊狀擴張卵泡、小卵泡及閉鎖卵泡，黃體數(shù)量下降，顆粒細(xì)胞層數(shù)減少。B組卵泡直徑為（865.32±32.25）μm，D組為（475.32±26.54）μm，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.013，P=0.000），B組大于D組。見圖2。

圖1 各組體重增長曲線 （n =9，±s）

圖2 各組卵巢組織形態(tài)變化 （HE 染色×100）

2.4 各組FBG、FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較

A組與B組喂養(yǎng)21 d 后糖耐量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.723，P=0.000）；兩組FBG、FINS、HOMA-IR 和定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.643、0.843、0.752 和0.154，P=0.423、0.132、0.298 和0.638）。見表3。

C組與D組49、77 及105 d 檢測的FBG、FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點FBG 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.422，P=0.654），不同時間點FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.943、3.131、3.452 和3.354，P=0.042、0.034、0.031和0.038）；②兩組FBG 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.436，P=0.543），兩組FINS、糖耐量、HOMAIR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義（F=13.541、12.321、18.496 和10.321， 均P=0.001），D組FINS、糖耐量、HOMA-IR 高于C組，C組定量胰島素敏感性檢測指數(shù)高于D組；③兩組FBG 變化趨勢比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.651，P=0.342），兩組FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.433、7.769、8.762 和3.354，P=0.002、0.008、0.003 和0.038）。見表4。

2.5 各組TG、TC 水平比較

A組和B組第21天TG分別為（96.42±4.36）和（136.91±7.65）mg/dl，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.80，P=0.000）。A組和B組第21 天TC 分別為（94.35±5.85）和（95.68±4.98）mg/dl，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.801，P=0.107）。

C組與D組49、77及105 d的TG、TC比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點TG、TC 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.324 和0.662，P=0.931 和0.322）；②兩組TG 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.962，P=0.121）；兩組TC 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.232，P=0.039），D組TC 高于C組；③兩組TG 變化趨勢比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.931，P=0.152），兩組TC 變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.419，P=0.042）。見 表5。

表3 A、B組檢測21 d 后FBG、FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較 （n =9，±s）

表3 A、B組檢測21 d 后FBG、FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較 （n =9，±s）

組別 FBG/（mg/dl） FINS/（mU/L） 糖耐量 HOMA-IR 定量胰島素敏感性檢測指數(shù)A組 132.54±4.25 2.58±0.52 321±3.53 0.89±0.11 0.41±0.009 B組 129.27±5.36 4.15±0.78 348±4.22 1.54±0.13 0.35±0.007

表4 C、D組不同時間點的FBG、FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較 （n =9，±s）

表4 C、D組不同時間點的FBG、FINS、糖耐量、HOMA-IR 及定量胰島素敏感性檢測指數(shù)比較 （n =9，±s）

注：?與C組比較，P ＜0.05。

組別 FBG/（mg/dl） FINS/（mU/L） 糖耐量 HOMA-IR 定量胰島素敏感性檢測指數(shù)C組 49 d 128.67±3.21 1.86±0.49 336.43±5.21 0.68±0.06 0.43±0.01 77 d 109.75±3.45 2.05±0.64 300.56±7.25 0.59±0.06 0.44±0.01 105 d 132.45±2.54 1.98±0.75 292.08±5.45 0.71±0.05 0.42±0.01 D組 49 d 130.44±2.14 3.02±0.35 318.12±5.57 1.10±0.09 0.39±0.01 77 d 115.61±2.98 10.22±0.86? 335.39±6.98? 3.25±0.16? 0.31±0.01? 105 d 133.24±3.24 12.21±0.99? 338.18±5.67? 4.39±0.26? 0.30±0.01?

2.6 各組血清性激素水平比較

A組與B組21 d 的E2、T 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.420 和14.200，均P=0.000），兩組LH、FSH、LH/FSH 及P 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.109、0.073、0.433 和0.773，P=0.759、0.859、0.532 和0.299）。見表6。

表5 C、D組不同時間點的TG、TC 水平比較 （n =9，mg/dl，±s）

表5 C、D組不同時間點的TG、TC 水平比較 （n =9，mg/dl，±s）

組別 TG TC C組 49 d 87.96±6.69 96.87±7.59 77 d 95.87±7.58 97.58±6.58 105 d 97.58±6.27 98.41±4.59 D組 49 d 84.54±5.98 102.68±5.74 77 d 89.54±6.54 98.57±5.66 105 d 91.24±7.56 119.54±6.27

表6 A、B組21 d 的血清性激素水平比較 （n =9，±s）

表6 A、B組21 d 的血清性激素水平比較 （n =9，±s）

注：?與A組比較，P ＜0.05。

組別 LH/（mIU/L） FSH/（mIU/L） LH/FSH E2/（ng/L） P/（ng/ml） T/（mIU/L）A組 8.13±0.39 10.36±0.58 0.81±0.05 60.87±4.98 126.98±5.36 4.89±0.54 B組 9.18±0.88 9.69±0.85 0.88±0.04 42.36±5.58? 130.12±6.95 8.89±0.65?

C組與D組49、77 及105 d 的LH、FSH、LH/FSH、E2、P 及T 比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點LH、FSH 及LH/FSH 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.834、0.932 和0.822，P=0.721、0.432 和0.651）；不同時間點E2、P 和T 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=32.321、14.543 和25.363，均P=0.001）；②兩組LH、FSH 和LH/FSH 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.883、0.793 和0.812，P=0.552、0.871和0.512）；兩組E2、P 和T 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.654、32.654 和12.343，均P=0.001），D組E2、P 水平低于C組，D組T 水平高于C組；③兩組LH、FSH、LH/FSH，E2、P 及T 變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.212、2.121、1.987、21.235、7.643和25.439，P=0.022、0.038、0.041、0.001、0.001 和0.001）。見表7。

2.7 各組LHR 和FSHR mRNA 相對表達(dá)量比較

A、B、C 及D組患者LHR mRNA 相對表達(dá)量分 別 為（1.02±0.12）、（1.25±0.63）、（1.08±0.14）和（2.68±0.64），F(xiàn)SHR mRNA 相對表達(dá)量分別為（1.01±0.11）、（0.82±0.36）、（1.02±0.12） 和（1.17±0.35）。各組患者LHR mRNA比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.580，P=0.001）；D組高于C組（P＜0.05）；各組FSHR 比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.648，P=0.065）。見圖3。

表7 C、D組不同時間點的血清性激素水平比較 （n =9，±s）

表7 C、D組不同時間點的血清性激素水平比較 （n =9，±s）

注：?與C組比較，P ＜0.05。

組別 LH/（mIU/L） FSH/（mIU/L） LH/FSH E2/（ng/L） P/（ng/ml） T/（mIU/L）C組 49 d 11.24±0.77 13.34±0.67 0.85±0.05 55.68±6.26 312.32±8.54 17.81±0.59 77 d 12.13±0.85 14.65±0.89 0.82±0.08 57.68±4.26 332.13±8.45 19.41±0.89 105 d 11.86±0.98 13.75±0.74 0.81±0.05 59.57±4.32 325.25±12.36 17.94±0.95 D組 49 d 10.89±0.81 12.56±0.54 0.79±0.04 45.53±7.34 159.55±10.35 18.35±0.34 77 d 11.19±0.68 13.98±0.69 0.78±0.06 43.53±3.34? 179.35±12.24? 21.03±1.24? 105 d 13.02±0.94 14.34±0.96 0.94±0.11 42.64±3.96? 206.36±11.24? 27.59±1.26?

圖3 各組LHR 和FSHR mRNA 相對表達(dá)量的變化 （n =9，±s）

3 討論

臨床PCOS 患者常見高雄激素血癥和高胰島素血癥[8]。本研究發(fā)現(xiàn)HFD 可誘導(dǎo)青春期前大鼠PCOS，其特征與臨床PCOS 患者癥狀相似。目前PCOS 動物模型復(fù)制主要是通過給予嚙齒類動物雌激素、抗孕酮、雄激素及來曲唑來誘導(dǎo)[9]。為觀察PCOS 的卵巢形態(tài)特征和代謝功能變化，本研究同時讓一組成年大鼠服用來曲唑以作為對照，結(jié)果顯示D、B組均出現(xiàn)PCOS卵巢特征，提示HFD 喂養(yǎng)青春期前大鼠與來曲唑誘導(dǎo)一樣均可復(fù)制PCOS 模型。

本研究中HFD 喂養(yǎng)的大鼠動情期階段的持續(xù)時間逐漸延長，表明改大鼠發(fā)情周期中斷。來曲唑喂養(yǎng)大鼠也出現(xiàn)發(fā)情不規(guī)律。在這2 種情況下，生育力都顯著受損。性激素水平的不平衡也造成了卵巢的結(jié)構(gòu)改變。囊腫卵泡數(shù)增加，囊壁增厚，顆粒細(xì)胞層減少或消失，B、D組大鼠顆粒細(xì)胞層減少，卵巢也顯示閉鎖卵泡增加和黃體減少。大鼠卵巢的這些組織病理學(xué)變化與PCOS 相似。

本研究連續(xù)HFD 喂養(yǎng)49 d 后逐漸觀察到大鼠糖耐量、FINS 及TG 異常。有學(xué)者臨床觀察到PCOS 患者伴隨胰島素抵抗會引起脂肪酶活性下降并導(dǎo)致TG異常[10]。HFD 喂養(yǎng)逐漸增加TC 而非TG 水平。在脫氫表雄酮聯(lián)合HFD 處理的C57BL/6 小鼠中也有報道TC 水平升高[11]。本研究中，HFD 喂養(yǎng)大鼠的激素變化可能是胰島素抵抗和高胰島素血癥的結(jié)果。來曲唑可減少雄激素在卵巢向雌激素的轉(zhuǎn)化，因此觀察到來曲唑喂養(yǎng)的大鼠中雌激素水平較低、睪酮水平較高。另有研究發(fā)現(xiàn)孕酮水平也降低[12]，與本研究觀察結(jié)果相似。

本研究中HFD 喂養(yǎng)大鼠的LH 和FSH 水平及其比例均未改變，但LHR 表達(dá)上調(diào)，對FSHR 表達(dá)影響不大。HFD 喂養(yǎng)的大鼠LH 水平未改變，可能是因為LH 處于動態(tài)變化過程中，清晨采血樣LH 可能并不是其變化區(qū)間。雖然相當(dāng)比例的PCOS 患者有LH/FSH改變，但LH/FSH 并不能作為PCOS 診斷指標(biāo)。高胰島素血癥可增加LHR 的表達(dá)，繼而可增強促性腺激素的卵巢類固醇的生成反應(yīng)，使其過早的顆粒分化，阻止卵泡生長并導(dǎo)致排卵[13]。由于LHR 表達(dá)未改變，所以單獨來曲唑治療的大鼠通常不存在高胰島素 血癥。

綜上所述，大鼠青春期前開始的HFD 誘導(dǎo)代謝功能紊亂和卵巢形態(tài)改變進(jìn)展緩慢，與臨床PCOS 患者觀察到的變化相似。與來曲唑誘導(dǎo)PCOS 模型相比，青春前期HFD 可能是通過產(chǎn)生高胰島素血癥誘導(dǎo)雄激素增多，誘導(dǎo)大鼠PCOS。該模型研究對于進(jìn)一步闡明PCOS 的發(fā)病機制具有重要意義。