綿羊CCCH 型鋅指蛋白基因ZC3H10 的mRNA 表達(dá)研究

李寶鈞，劉少貞，任有蛇，喬利英，劉建華，王偉偉，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

“鋅指”是一種小的蛋白結(jié)構(gòu)基元，可以結(jié)合1 個或幾個鋅離子保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。鋅指蛋白包括眾多不同結(jié)構(gòu)的蛋白家族，如CCHH 型、C4 型、C6 型和CCCH型等[1]，鋅指蛋白的典型功能是與DNA、RNA、蛋白以及其他分子結(jié)合。CCCH 型鋅指蛋白（Cys-Cys-Cys-His，Cys 為半胱氨酸，His 為組氨酸）包括1～6 個CCCH 型鋅指基元。CCCH 型鋅指基元氨基酸序列最初被定義為C-X6-14-C-X4-5-C-X3-H，X 表示其他氨基酸，目前被定義為C-X4-15-C-X4-6-C-X3-H[2]，其中最常見的形式是C-X7-C-X5-C-X3-H 和C-X8-C-X5-C-X3-H。與其他類型鋅指蛋白相比，CCCH 鋅指蛋白的研究較少。

家畜中胴體脂肪含量決定肉類產(chǎn)品的嫩度、汁液含量和風(fēng)味。調(diào)控體內(nèi)脂肪沉積，生產(chǎn)脂肪含量適中的羊肉是肉羊育種的主要目標(biāo)之一。成體動物的脂肪沉積主要為脂肪細(xì)胞的增加或脂肪體積的增加，而成體動物脂肪細(xì)胞的增加則由脂肪組織中前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化來實現(xiàn)。因此，探明前體脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制對于調(diào)控綿羊的脂肪沉積非常重要。前體脂肪細(xì)胞的分化由眾多轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白所調(diào)控。本課題組前期已經(jīng)對部分綿羊脂肪沉積相關(guān)蛋白基因進(jìn)行了組織表達(dá)研究[3-5]。最新研究表明，ZC3H10 促進(jìn)肌肉細(xì)胞的分化，而ZC3H10 的純合突變子表現(xiàn)為脂肪含量升高和體內(nèi)脂肪分布改變[6]。因此，ZC3H10 可能在脂肪細(xì)胞分化或脂肪代謝過程中發(fā)揮作用。本實驗旨在研究綿羊ZC3H10 在不同脂肪組織部位和其他主要器官組織的mRNA 表達(dá)，以及在體外綿羊脂肪細(xì)胞分化模型中研究ZC3H10 隨細(xì)胞分化的mRNA 表達(dá)規(guī)律，為研究ZC3H10 在綿羊脂肪沉積中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗中屠宰程序和飼養(yǎng)管理按照中華人民共和國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 13078-2017）、畜類屠宰加工通用技術(shù)條件（GB/T 17237-2008）和無公害食品肉羊飼養(yǎng)獸藥使用準(zhǔn)則（NY 5148-2002）進(jìn)行。選取4 只10 月齡小尾寒羊去勢公羊（飼養(yǎng)條件相同）進(jìn)行屠宰，并分別采集皮下脂肪組織以及心臟、腎、肝、肺、脾、小腸和肌肉（背最長肌）等組織樣品，快速用鋁箔紙包裹，置于液氮中，隨后帶回實驗室保存于-80℃，用于實時熒光定量PCR。

考慮到方便取材，采用1 周齡晉中綿羊作為細(xì)胞培養(yǎng)的實驗動物。綿羊前體脂肪細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與分化參照趙艷艷等[7]的方法。如圖1-A 所示，分離培養(yǎng)的前體脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形、星形、三角形等形態(tài)。如圖1-B 所示，分化10 d 的脂肪細(xì)胞，其間有白色透亮的脂滴聚集。在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的0、2、4、6、8、10 d 分別收集細(xì)胞，每個時間點3 個重復(fù)，用于實時熒光定量PCR。

圖1 培養(yǎng)的綿羊前體脂肪細(xì)胞（A）和分化10 d 的脂肪細(xì)胞(B)

1.2 生物信息學(xué)在線平臺 使用SMART 工具（http://smart.embl-heidelberg.de）對綿羊ZC3H10 基因翻譯的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。使用Nucleotide BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析綿羊ZC3H10 基因與其他物種的序列同源性；進(jìn)化樹構(gòu)建平臺為Phylogeny.fr（http://www.phylogeny.fr/）。進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹的各物種序列信息：綿羊（XM_027967606.1）、爪蟾（NM_001008144.2）、斑馬魚（NM_207098.1）、家鼠（XM_006513013.2）、雞（XM_015300307.2）、牛（NM_001097993.1）、 豬（XM_003126269.6） 和人（NM_001303124.1）?；虮磉_(dá)熱圖在Omicshare平臺完成（http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/heatmap）。以上分析均采用默認(rèn)參數(shù)完成。

1.3 總RNA 提取 綿羊各組織和培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA 按照Trizol（TaKaRa 公司，美國）試劑盒說明書進(jìn)行提取。RNA 濃度用NanoDrop 公司的核酸濃度測定儀檢測，樣品的OD260/280值在1.8～2.0。RNA 完整性通過1.2%凝膠電泳檢測，28S 條帶亮度約為18S 條帶亮度的2 倍。提取的總RNA 保存于-80℃。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于Li 等[8]文獻(xiàn)。用于轉(zhuǎn)錄組測序的腎周、皮下、尾部脂肪組織來自4 只10 月齡小尾寒羊去勢公羊，同1.1。

1.5 反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR 根據(jù)TaKaRa 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈。熒光定量PCR 儀為Applied Biosystems 公司的7500 Fast Real-Time PCR System，熒光定量PCR 試劑盒為TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10.0 μL，PCR 正反向引物各0.8 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 模板2.0 μL，去RNA 酶超純水6.0 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 30 s； 95℃ 5 s 和60℃ 34 s，45 個循環(huán)；熔解曲線階段為95℃ 15 s，60℃ 1 min，再以每10 s 0.5℃的速率從60℃上升到95℃。每個樣品進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。RPL13A 由于表達(dá)穩(wěn)定而作為內(nèi)參基因。特異性引物通過在線工具Primer-BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）設(shè)計而成，引物序列見表1?；虻膍RNA 相對表達(dá)量由2-ΔΔCT方法計算得出。

1.6 統(tǒng)計分析 運(yùn)用SPSS 19.0 軟件中單因素方差分析檢驗ZC3H10 基因在綿羊各種不同組織間或綿羊前體脂肪細(xì)胞分化的各時間點的表達(dá)差異性，各組織或各時間點基因表達(dá)量間的差異采用Duncan′s 法進(jìn)行多重比較。P＜0.05 表示差異顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊ZC3H10 基因序列的生物信息學(xué)分析 ZC3H10基因（NCBI ID：114108653）位于綿羊3 號染色體，含有3 個外顯子。綿羊ZC3H10 基因序列與各物種同源序列間具有較高的保守性，其mRNA 序列與爪蟾、斑馬魚、雞、小鼠、豬、牛和人的一致性（Identities）分別為67.32%、71.62%、73.27%、82.85%、88.73%、97.23%和90.86%，其中與牛的序列一致性最高。ZC3H10 基因編碼的蛋白質(zhì)基元序列非常保守，稱為“CCCH 鋅指”；綿羊ZC3H10 基因翻譯的氨基酸序列在128～154、167～190 和226～252 位 置 有3 個CCCH 鋅 指。ZC3H10基因進(jìn)化樹顯示（圖2），斑馬魚和非洲爪蟾與其他物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)，各列為一支；雞與其他家畜及家鼠形成分支；家鼠與其他家畜形成分支，豬和人列為一支，牛和羊列為一支。

表1 實時熒光定量PCR 所用引物

圖2 ZC3H10 基因進(jìn)化樹

2.2 ZC3H10 基因在綿羊不同部位脂肪組織的mRNA 表達(dá) 根據(jù)Li 等[8]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，按照mRNA 表達(dá)水平高低將所有檢測到的基因進(jìn)行排序，ZC3H10 基因在綿羊腎周脂肪、皮下脂肪和尾部脂肪轉(zhuǎn)錄組所有基因中的排名分別為第20、16、18。這說明ZC3H10 基因在這3 種脂肪組織中均有很高的mRNA 表達(dá)水平。將3 個脂肪組織轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)量最高的前20 個基因進(jìn)行交集，獲得12 個基因，包括TMSB4、FABP4、ADIPOQ、VIM、ZC3H10 基因和7 個核糖體蛋白基因，即RPLP1、RPS12 、RPS8、RPS11、RPL27a、RPL31 和RPS24。根據(jù)這12 個基因在3 種脂肪組織中的mRNA表達(dá)豐度，將其進(jìn)行聚類分析。如圖3 所示，所有基因被分為4 組，F(xiàn)ABP4、ADIPOQ 和ZC3H10 聚為一組，其他7 個核糖體蛋白基因聚為一組，TMSB4（Thymosin β4，胸腺素β4）和VIM（Vimentin，波形蛋白）各為一組。

2.3 ZC3H10 基因在綿羊各器官組織的mRNA 表達(dá) 圖4 表明， ZC3H10 在綿羊皮下脂肪、心臟、腎、肝、肺、脾、小腸和肌肉等器官組織中均有表達(dá)。ZC3H10 在肌肉組織中的mRNA 表達(dá)最高，顯著高于其他組織。ZC3H10在腎中的表達(dá)僅次于肌肉，與心、肝、脾和小腸中的表達(dá)差異不顯著，但顯著高于脂肪和肺。ZC3H10 在脂肪中的mRNA 表達(dá)顯著高于肺，顯著低于肌肉和腎，與心臟、肝、脾、小腸間的表達(dá)差異不顯著。ZC3H10 在肺中的mRNA 表達(dá)最低，且顯著低于其他各組織。

圖3 12 個高表達(dá)基因在脂肪組織中的mRNA 表達(dá)熱圖

圖4 綿羊ZC3H10 mRNA 的組織表達(dá)

2.4 ZC3H10 基因在綿羊體外前體脂肪細(xì)胞分化過程中的mRNA 表達(dá) 由圖5 可知，隨著前體脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)行，綿羊ZC3H10 基因mRNA 的表達(dá)呈下調(diào)趨勢。ZC3H10 在前體脂肪細(xì)胞（分化0 d）中的mRNA 水平顯著高于分化過程中的任何時期。ZC3H10 在前體脂肪細(xì)胞分化2 d 的mRNA 表達(dá)顯著高于4、6、8、10 d；而前體脂肪細(xì)胞分化4、6、8 d 的mRNA 表達(dá)差異不顯著。細(xì)胞分化10 d 的ZC3H10 mRNA 表達(dá)在所有檢測的時間點中表達(dá)最低，且顯著低于其他時期。

圖5 ZC3H10 基因在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中的mRNA 表達(dá)

3 討 論

3.1 ZC3H10 基因的表達(dá)與功能 本研究表明， 綿羊ZC3H10 在不同器官組織中均有表達(dá)，且在肌肉中表達(dá)最高，在肺中表達(dá)最低。人ZC3H10 基因在脂肪、心臟、腎、肝、肺、脾、小腸等28 種組織中均有表達(dá)[9]。小鼠ZC3H10 基因在胚胎的神經(jīng)、腦、肢等器官組織以及成體的心、腎、肺和脂肪等組織中表達(dá)[10]。這些研究顯示ZC3H10 基因的mRNA 廣泛表達(dá)于各種組織，但其表達(dá)有種屬差異性，在同一物種中也存在組織差異性。

鋅指結(jié)構(gòu)具有與核酸作用的能力。在Hela 細(xì)胞中的研究表明，ZC3H10 可做為RNA 結(jié)合蛋白與mRNA結(jié)合[11]。 Treiber 等[12]研究表明，ZC3H10 可結(jié)合到多種細(xì)胞系的microRNA。ZC3H10 在哺乳動物癌細(xì)胞系MCF-7 中可作為腫瘤抑制因子[13]。Audano 等[6]研究顯示，ZC3H10 在C2C12 肌肉細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào)，ZC3H10 過表達(dá)促進(jìn)了肌母細(xì)胞的分化，敲除ZC3H10 則導(dǎo)致肌母細(xì)胞分化的抑制。人ZC3H10 突變的純合子呈現(xiàn)身體質(zhì)量指數(shù)和脂肪含量的升高和脂肪分布改變[6]。這些結(jié)果提示ZC3H10 在脂肪代謝中可能發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ZC3H10 在綿羊不同部位的脂肪組織中均有很高的mRNA 表達(dá)，且與脂肪沉積相關(guān)基因脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Protein 4，F(xiàn)ABP4）和脂聯(lián)素（Adiponectin，ADIPOQ）有相似的表達(dá)模式。這說明ZC3H10 基因可能與這2 個基因有相似的功能。FABP4 在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和動物脂肪沉積中發(fā)揮作用。FABP4 多態(tài)性與牛的脂肪沉積顯著相關(guān)[14]。ADIPOQ 是脂肪細(xì)胞分泌的主要脂肪細(xì)胞因子，調(diào)控葡萄糖的代謝與脂肪酸氧化[15]。ADIPOQ 的多態(tài)性與牛肉的大理石花紋顯著相關(guān)[16]。因此，ZC3H10 可能在脂肪代謝中發(fā)揮作用。發(fā)育生物學(xué)研究顯示，脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的發(fā)育來源相同，均來自于發(fā)育早期中胚層細(xì)胞，一些促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化的基因往往抑制脂肪細(xì)胞的分化，如SIRT1[17]、Wnt10b[18]等。本研究表明，ZC3H10 的表達(dá)隨著綿羊前體脂肪細(xì)胞的分化而下調(diào)，所以綿羊ZC3H10 可能抑制脂肪細(xì)胞的分化。

3.2 鋅指蛋白在脂肪細(xì)胞分化中的作用 PPARγ 和C/EBP是脂肪細(xì)胞分化和基因表達(dá)的主控因子[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)不少鋅指蛋白通過作用PPARγ 或C/EBP 促進(jìn)或者抑制脂肪細(xì)胞的分化。在脂肪細(xì)胞分化中起正調(diào)控作用 的CCHH 型 鋅 指 蛋 白KLFs（Krupel-like factors）有KLF4、KLF5、KLF6 和KLF15；起負(fù)調(diào)控作用的CCHH 型鋅指蛋白有KLF2、KLF3 和KLF7[20]。CCHH型鋅指蛋白638（Zinc Finger Protein 638，Zfp638）和SNAIL2 均促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。而C2C2 型鋅指蛋白GATA2 和GATA3 是脂肪細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控因子[21]。本研究中的ZC3H10 有望成為影響脂肪細(xì)胞分化的新的鋅指蛋白成員。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，CCCH 型鋅指蛋白基因ZC3H10在綿羊主要器官組織均有mRNA 表達(dá)，在不同脂肪部位有較高的mRNA 表達(dá)。在體外綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中，ZC3H10 mRNA 的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。需要進(jìn)一步開展功能喪失或功能獲得等實驗研究，繼續(xù)探明ZC3H10 基因在脂肪細(xì)胞分化和代謝中的功能以及作用機(jī)制。