膜聯(lián)蛋白A8 在小鼠早期妊娠子宮中表達(dá)研究

任 杰，崔云鳳，于浩楠，吳 浩，倪 華

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

胎生哺乳動(dòng)物在正常生理狀態(tài)下，胚泡植入母體子宮進(jìn)行下一步的發(fā)育生長(zhǎng)，即胚胎著床。胚胎著床過程對(duì)于妊娠能否順利進(jìn)行至關(guān)重要，成功的胚胎著床依賴于同步發(fā)育的子宮和胚胎之間精確的相互作用[1]。畜牧動(dòng)物繁殖性能的高低是影響?zhàn)B殖行業(yè)發(fā)展的重要瓶頸，胚胎著床率低是動(dòng)物繁殖力低下的主要原因之一。胚胎工程技術(shù)中，體外操作過的胚胎著床和發(fā)育到期比率更低。因此，關(guān)于胚胎著床機(jī)制的研究具有理論意義和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

膜聯(lián)蛋白-A8（Annexin A8，ANXA8）屬于膜聯(lián)蛋白超家族（Annexins）[2]。目前，在高等脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)至少12 種膜聯(lián)蛋白，它們可以鈣依賴性方式與陰離子磷脂結(jié)合，介導(dǎo)某些特定蛋白分子在膜上的定位，從而調(diào)節(jié)這些蛋白的功能[3-4]。ANXA1[5]、ANXA2[6]、ANXA4[7]被證明與人和小鼠胚胎著床相關(guān)。ANXA8 與多種癌癥發(fā)生有關(guān)，ANXA8 是口腔鱗狀細(xì)胞癌檢測(cè)的分子標(biāo)記物[8]；ANXA8 是胰腺癌中過表達(dá)的4 種基因之一[9]；ANXA8 在子宮鱗狀細(xì)胞癌中顯著上調(diào)[10]；ANXA8 的表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生存有顯著影響[11]。ANXA8 與小鼠視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的分化有關(guān)[12]。在豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，ANXA8 可上調(diào)著床關(guān)鍵因子（Leukemia Inhibitory Factor，LIF）的mRNA 表達(dá)，提示ANXA8可能通過調(diào)節(jié)LIF 影響豬的胚胎著床[13]，受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)手段的限制，這部分工作是在體外培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行，關(guān)于ANXA8 在小鼠和其他動(dòng)物圍著床期子宮中的表達(dá)和作用機(jī)制尚無報(bào)道。由于小鼠是模式動(dòng)物，具有研究胚胎著床的體內(nèi)模型和體外細(xì)胞模型，便于深入開展ANXA8 研究。本研究采用原位雜交、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)的方法，從RNA 和蛋白水平檢驗(yàn)ANXA8 在小鼠早期妊娠胚胎著床中的表達(dá)，在體外培養(yǎng)的小鼠基質(zhì)細(xì)胞及誘導(dǎo)蛻膜中，研究ANXA8 的作用，為闡明ANXA8 在動(dòng)物胚胎著床中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究ANXA8 在大動(dòng)物胚胎著床中的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6J 品系小鼠。小鼠于人工控制條件下飼養(yǎng)，室溫為19～23℃，光照周期分為光照黑暗各12 h，自由采食和飲水，定期更換墊料、添補(bǔ)食物和水。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

1.2.1 早期妊娠 將自然發(fā)情的成年雌鼠與成年可育雄鼠按2:1 合籠。次日早晨檢查發(fā)現(xiàn)陰道栓記為妊娠第1天，分別于每天09:00 收集小鼠妊娠第1～8 天子宮。收集小鼠妊娠第2～4 天子宮時(shí)，須從輸卵管或子宮中沖出胚胎以確定妊娠。收集小鼠妊娠第5 天子宮時(shí)，尾靜脈注射1%的芝加哥藍(lán)以確定著床位點(diǎn)。將子宮切成適當(dāng)大小，一部分組織經(jīng)液氮速凍后放入-80℃冰箱凍存。另一部分用固定液固定進(jìn)行石蠟包埋處理。

1.2.2 人工誘導(dǎo)蛻膜化 雌鼠在假孕第4 天上午，在小鼠右側(cè)子宮靠近輸卵管的部分注射芝麻油25 μL 誘導(dǎo)蛻膜化，另一側(cè)不注射，作為對(duì)照。在假孕第8 天上午處死小鼠，按以上方法取子宮角。利用形態(tài)變化及稱重來分辨是否發(fā)生蛻膜化，取材方法同上。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠 ANXA8 基因片段克隆及探針的制備 根據(jù)GenBank 相關(guān)序列設(shè)計(jì)小鼠ANXA8 基因的上、下游引物（上游引物：5'-GCGGGTGAGAAGATTATGGGA-3'；下 游 引 物：5'-AAGTAGCTGTGGACGTTCCG -3'），以小鼠子宮 cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用Magen凝膠回收試劑盒純化產(chǎn)物。將回收的產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落進(jìn)行搖菌，得到的菌液送交哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，將測(cè)序正確的ANXA8 基因片段，利用Roche 公司的地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記。

1.3.2 原位雜交 將10 μm 冰凍切片放入4% 多聚甲醛（PFA，pH 9～10）中固定1 h，1% TritonX-100 溶液處理切片20 min 后室溫下預(yù)雜交15 min（5×SSC，50%甲酰胺）。棄去預(yù)雜交液，后滴加雜交液（5×SSC，50%甲酰胺，0.02% BSA，10%硫酸葡聚糖，1 mg/mL變性的地高辛標(biāo)記的ANXA8 RN 探針）于55℃雜交24 h。將切片分別在含有50% 甲酰胺和5×SSC、2×SSC、0.2×SSC 的溶液中55℃搖床洗滌15、30、30 min，再將切片放入0.2×SSC 溶液中，于室溫下靜置洗滌5 min。經(jīng)緩沖液Ⅰ（100 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5）平衡5 min 后在1% Blocking solution 中封閉1 h，封閉后加堿性磷酸標(biāo)記的地高辛抗體（1:5 000；Roche）4℃孵育過夜。切片洗滌后，再滴加顯色液（0.4 mmol/L 5-溴-4-氯-3- 吲哚磷酸，0.4 mmol/L 硝基四唑氮藍(lán)和2 mmol/L 左旋咪唑），避光顯色過夜，出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)后，停止顯色。1%甲基綠復(fù)染，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取小鼠子宮組織50～100 mg，提取組織總RNA，并將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，ANXA8（序列號(hào)：NM-013473.4）引物序列：上游引物5'-GCGGGTGAGAAGATTATGGGA-3'，下游引物5'-AAGTAGCTGTGGACGACGTTCCG-3'，由哈爾濱博仕生物公司合成。反應(yīng)體系10 μL：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，Rox ReferenceDye Ⅱ 0.2 μL，上游引物0.2 μL(10 μmol/L)，下游引物0.2 μL(10 μmol/L), RNA 4.4 μL (8.8 μmol/L)。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s、60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)后收集熒光信號(hào)。使用 Amplied Biosystems?7500 Real-Time PCR System 操作，由儀器自動(dòng)繪制熔解曲線，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 免疫組織化學(xué) 取得小鼠子宮組織，固定包埋后，切成5 μm 厚的切片。切片脫蠟至蒸餾水，0.01%檸檬酸緩沖液修復(fù)、3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶、10%馬血清封閉后，加入Annexin Ⅷ Rabbit polyclonal antibody（1:80，proteintech），4℃過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1:200，ab6721，abcam），37℃孵育90 min。DAB 顯色劑顯色，蘇木精染色液復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果都通過 t 檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，定量結(jié)果按x±s 的形式由 Graphpad Prism 軟件進(jìn)行繪圖處理，并用 2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)蛻膜化處理 將妊娠第4 天小鼠的子宮角縱向切開，用HBSS（含P/S）（Gibco）徹底洗滌后，將子宮組織置于含有1%胰蛋白酶（Sigma）的HBSS（含P/S）中，4℃下1 h，室溫下15 min，37℃下15 min，輕輕搖動(dòng)裝有小鼠子宮組織的三角瓶以移除上皮細(xì)胞，棄去含有上皮細(xì)胞的上清液后，用HBSS（含P/S）沖洗剩余的組織3 次，并在含有0.5 mg/mL 膠原酶Ⅱ（Biotopped）的HBSS（含P/S）中37℃溫育30 min，將消化的子宮劇烈搖動(dòng)直至上清液混濁。然后將上清過濾后，在1 000 r/min 離心5 min。細(xì)胞沉淀用HBSS（含P/S）洗滌2 次，并重懸于由DMEM/F-12（Sigma）和10% 活性炭吸附過的胎牛血清組成的完全培養(yǎng)基中；1×106個(gè)細(xì)胞接種到35 mm 直徑培養(yǎng)盤中，培養(yǎng)30 min 后，更換培養(yǎng)基以除去游離的漂浮細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)[14]。

小鼠基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%時(shí)開始誘導(dǎo)蛻膜化，更換新鮮培養(yǎng)液，加入10 nmol/L 雌激素（Sigma）和1 μmol/L 孕酮（Sigma），對(duì)照組中按體積比1:1 000加入無水乙醇。分別收集處理后24、48、72 h 的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，提取RNA。蛻膜化標(biāo)志分子采用小鼠蛻膜催乳素相關(guān)蛋白（Decidual Prolactin-related Protein, Dtprp），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)DTPRP 和ANXA8 mRNA 的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 ANXA8 mRNA 在早期妊娠第1～8 天與人工蛻膜化子宮中的表達(dá) 原位雜交結(jié)果表明，ANXA8 mRNA 在小鼠早期妊娠第1～4 天子宮腔上皮和腺上皮有微弱表達(dá)（圖1-A～D）。隨著妊娠的進(jìn)行，胚胎在第4 天子夜著床，并且在著床位點(diǎn)周圍形成初級(jí)蛻膜區(qū)。ANXA8 mRNA在第5、6 天的初級(jí)蛻膜區(qū)（圖1-E、F）表達(dá)，隨后初級(jí)蛻膜區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)增殖分化成次級(jí)蛻膜區(qū)，ANXA8 mRNA 在第7、8 天的次級(jí)蛻膜區(qū)（圖1-G、H）表達(dá)，并逐漸增強(qiáng)。人工蛻膜化模型中ANXA8 mRNA表達(dá)在蛻膜區(qū)（圖1-I）。

2.2 ANXA8 蛋白在早期妊娠與人工蛻膜化子宮中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，早期妊娠第1～4 天的腔上皮和腺上皮有ANXA8 蛋白表達(dá)（圖2-A～D），早期妊娠第5～8 天中ANXA8 蛋白表達(dá)方式與mRNA 類似，第5、6 天初級(jí)蛻膜區(qū)（圖2-E、F）與第7、8 天的次級(jí)蛻膜區(qū)（圖2-G、H）有表達(dá)；在人工蛻膜化模型中，對(duì)照一側(cè)子宮腔上皮和腺上皮（圖2-J）檢測(cè)到ANXA8 蛋白的存在，人工蛻膜子宮的蛻膜區(qū)（圖2-I）有ANXA8 蛋白表達(dá)。

2.3 ANXA8 mRNA 在體外誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，蛻膜化標(biāo)志分子DTPRP 的表達(dá)逐漸升高，并顯著高于對(duì)照組，表明誘導(dǎo)蛻膜化成功( 圖3-A)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，ANXA8 的表達(dá)逐漸升高，并顯著高于對(duì)照組(圖3-B)。

圖1 ANXA8 在早期妊娠與人工蛻膜化子宮中的mRNA 表達(dá)

圖2 ANXA8 在小鼠早期妊娠與人工蛻膜化子宮中的蛋白表達(dá)

圖3 ANXA8 在體外誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞中的mRNA 表達(dá)

3 討 論

Jiang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ANXA8 在妊娠第11～13 天的豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的表達(dá)水平較高。在培養(yǎng)的豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，過表達(dá)ANXA8 會(huì)上調(diào)LIF 和表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal Growth Factor，EGF），促進(jìn)蛋白激酶 B（Protein Kinase B，AKT）的磷酸化，活化AKT 信號(hào)通路，促進(jìn)豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖；向小鼠子宮角灌注ANXA8 的siRNA 會(huì)減少胚胎的著床數(shù)量[13]。雖然ANXA8 降低會(huì)影響小鼠胚胎著床結(jié)局，但是ANXA8在小鼠圍著床期子宮中的表達(dá)變化未知，siRNA 干涉導(dǎo)致胚胎的著床數(shù)量減少機(jī)制未知?；谝陨象w外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ANXA8 在小鼠胚胎著床中表達(dá)與調(diào)節(jié)，結(jié)果表明，在小鼠早期妊娠第1～4 天，ANXA8 定位于子宮的腔上皮和腺上皮，LIF 主要在小鼠子宮腔上皮和腺上皮以及部分基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，小鼠圍著床期子宮腔上皮和腺上皮中 ANXA8 可能作為L(zhǎng)IF 上游調(diào)控分子，參與小鼠胚胎著床過程。本研究與豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞中研究[13]相對(duì)一致。

本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到ANXA8 在小鼠妊娠第5～6 天定位于初級(jí)蛻膜區(qū)域中，第7～8 天強(qiáng)表達(dá)于次級(jí)蛻膜區(qū)域中；第8 天在注射芝麻油的人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮中，蛻膜區(qū)也發(fā)現(xiàn)ANXA8 信號(hào)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR也進(jìn)一步驗(yàn)證了以上結(jié)果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，除子宮腔上皮外，ANXA8 定位于蛻膜組織，而且隨蛻膜化的進(jìn)行，ANXA8 表達(dá)增強(qiáng)，提示ANXA8 參與子宮基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過程。鑒于小鼠子宮蛻膜中含蛻膜細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞，為了明確ANXA8 是否參與子宮基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化過程，本研究體外培養(yǎng)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)蛻膜化，在72 h 內(nèi)，蛻膜化標(biāo)志分子DTPRP顯著上升，表明細(xì)胞的確向蛻膜細(xì)胞分化。在這個(gè)過程中，ANXA8 表達(dá)明顯升高，這說明ANXA8 在小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中發(fā)揮作用。目前，ANXA8 在胚胎著床中的研究只有Jiang 等[13]的1 篇報(bào)道。由于豬和小鼠胚胎著床方式不同，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANXA8 在子宮腔上皮中的定位與子宮接受性建立有關(guān)，并且證明ANXA8 參與小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程。

蛻膜是胚胎早期發(fā)育的微環(huán)境，蛻膜化起始時(shí)類似于炎癥反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)入免疫耐受以維持蛻膜中的免疫平衡保證胚胎正常發(fā)育[14]。蛻膜化過程中，伴隨大量的免疫細(xì)胞募集，這些免疫細(xì)胞在蛻膜中分化，分泌細(xì)胞因子，維持蛻膜中獨(dú)特的免疫環(huán)境，并且促進(jìn)血管發(fā)生，為胎盤發(fā)育奠定基礎(chǔ)。有研究表明，ANXA8 在白細(xì)胞募集中發(fā)揮作用，P- 選擇素作為白細(xì)胞受體可以在炎癥激活的血管內(nèi)皮表面募集白細(xì)胞和血小板，P- 選擇素在內(nèi)皮細(xì)胞表面被CD63 穩(wěn)定。在人臍靜脈內(nèi) 皮 細(xì) 胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECS）中，干擾ANXA8 后細(xì)胞表面的CD63 和P-選擇素的表達(dá)明顯下降，并顯示出白細(xì)胞遷移和粘附的缺陷[15]。小鼠子宮蛻膜中高表達(dá)ANXA8，ANXA8 是否參與免疫細(xì)胞的招募值得進(jìn)一步研究。

有研究表明，ANXA8 參與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEG） 促 進(jìn) 的血管發(fā)生。在HUVECS 中，干擾ANXA8 表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞遷移和粘附到β1 整合素連接的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的能力受到損害，導(dǎo)致VEGF 促進(jìn)的血管發(fā)生削弱。ANXA8 促進(jìn)CD63 在細(xì)胞表面的呈現(xiàn)促進(jìn)CD63/VEGFR2/β1 復(fù)合物的形成，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和粘附[16]。小鼠子宮蛻膜中表達(dá)VEGF，并且進(jìn)行血管發(fā)生。本研究推測(cè)蛻膜中高表達(dá)ANXA8 可能與蛻膜中血管形成及血管重塑有關(guān)。

在Hela 細(xì)胞中，ANXA8 特異性地與晚期內(nèi)體和F-肌動(dòng)蛋白（F-actin）結(jié)合。改變細(xì)胞內(nèi)ANXA8 水平并顯著影響晚期內(nèi)體的形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)分布，進(jìn)而影響晚期內(nèi)體介導(dǎo)的內(nèi)吞和溶酶體降解。例如，ANXA8 降低會(huì)減弱EGF 和表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）通過溶酶體的降解，導(dǎo)致EGF 誘導(dǎo)的促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）激活的延長(zhǎng)，從而引起不平衡的信號(hào)傳導(dǎo)[17]。EGF 是胚胎植入過程中關(guān)鍵因子[18]，ANXA8有可能通過調(diào)節(jié)EGF 信號(hào)通路影響小鼠胚胎著床。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，ANXA8 mRNA 在早期妊娠第1～4 天的腔上皮與腺上皮和部分基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在第5～8 天的蛻膜區(qū)表達(dá)并逐漸增高，在人工蛻膜化模型中人工蛻膜側(cè)高于對(duì)照側(cè)。ANXA8 蛋白的表達(dá)與ANXA8 mRNA表達(dá)類似，并且在體外培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，隨著誘導(dǎo)蛻膜化天數(shù)的增加ANXA8 也呈上升趨勢(shì)，證明ANXA8 在小鼠胚胎著床和蛻膜化過程發(fā)揮重要作用。本研究首次揭示了ANXA8 在小鼠圍著床期子宮中的表達(dá)規(guī)律，證明ANXA8 在小鼠胚胎著床和蛻膜化過程發(fā)揮重要作用，為后續(xù)在家畜中的研究奠定基礎(chǔ)。