質(zhì)子感知受體OGR1介導(dǎo)酸化環(huán)境對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞活力和成管作用的影響*

徐 吉， 丁聲龍， 陳方毅， 張繼紅， 桂柯科， 熊 敏， 李 炳， 趙明東△

(復(fù)旦大學(xué)金山醫(yī)院 1骨科， 2中心實(shí)驗(yàn)室， 上海 201508； 3復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院， 上海 200032)

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)的特征是微循環(huán)血供損傷后發(fā)生骨細(xì)胞死亡，由于局部微循環(huán)障礙，股骨頭缺血，導(dǎo)致局部微環(huán)境pH降低(酸化)[1]。研究證實(shí)， ANFH的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多因素、多途徑和多階段的復(fù)雜過(guò)程，局部血管功能失調(diào)被認(rèn)為是股骨頭發(fā)生缺血壞死的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)，被稱為是“髖關(guān)節(jié)的冠心病”[2]，而血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在維持血管穩(wěn)定及血管新生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。

在ANFH 的股骨頭血管修復(fù)及新生過(guò)程中，各種危險(xiǎn)因素對(duì)EPCs的影響至關(guān)重要，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注并對(duì)骨髓EPCs調(diào)控ANFH發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了深入研究[3]。由于各種骨內(nèi)、外致病因素引起骨組織營(yíng)養(yǎng)血流減少、骨內(nèi)血管網(wǎng)受壓或流出靜脈阻塞，造成局部血供障礙，骨組織缺血，乳酸濃度升高，質(zhì)子(H+)增加[4]，但是缺血缺氧性酸化如何調(diào)控EPCs在ANFH的作用途徑尚未清楚。

2003年，Ludwig等[5]在 Nature 雜志上首次報(bào)道了卵巢癌G蛋白偶聯(lián)受體1(ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1，OGR1)為質(zhì)子感知受體(proton-sensing receptor)。OGR1是細(xì)胞膜上感知酸性環(huán)境的受體之一，對(duì)H+敏感，并負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控胞內(nèi)一些病理生理反應(yīng)[6]。在一些組織酸化的病理?xiàng)l件下，如哮喘等炎癥性疾病的氣道組織中，pH降低可激活OGRl，引發(fā)氣道平滑肌細(xì)胞分泌炎癥因子和氣道黏液分泌增多等病理反應(yīng)[7]。Saxena等[8]發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)OGR1并介導(dǎo)酸誘導(dǎo)的細(xì)胞Ca2+信號(hào)，敲除OGR1基因明顯抑制酸誘導(dǎo)的氣道平滑肌收縮，表明OGR1在哮喘氣道平滑肌收縮過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。以上學(xué)者的研究為防治由pH值降低(酸化)引起氣道阻力增加的非特異性哮喘等疾病提供了新思路。那么，EPCs是否表達(dá)OGR1，深入探討OGR1在EPCs的表達(dá)對(duì)防治血管損傷性疾病，如ANFH，有重要意義。本研究分析EPCs中OGR1的表達(dá)水平，并分析OGR1介導(dǎo)的酸化效應(yīng)對(duì)EPCs的生長(zhǎng)、遷移和成管作用的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性BALB/c小鼠，體重18～20 g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)為20170005011053。實(shí)驗(yàn)室溫度控制在20～25 ℃，濕度在50%～60%，自由飲水。

2 主要試劑與儀器

DEPC、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)和單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)(Sigma)；TRIzol(Invitrogen)；Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(Fermentas)；抗DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ抗體及II抗(Santa Cruz)；硝酸纖維素膜(Whatman)；EGM-2 Single Quots培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和0.25%胰蛋白酶(HyClone)；Matrigel基質(zhì)膠(Thermo Scientific)；碘化丙錠(propidium iodide，PI)、結(jié)晶紫溶液和總蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；抗OGR1抗體(CST)；抗β-actin抗體及II抗(上海生工生物工程有限公司)。Hema18R冷凍離心機(jī)和壓縮機(jī)制冷式基因擴(kuò)增儀均為珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

3 方法

3.1小鼠骨髓源性EPCs的分離與培養(yǎng) 根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[9]，簡(jiǎn)述如下：每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉后頸椎脫臼法迅速處死并置入75%乙醇中浸泡45 min。用注射器沖洗小鼠脛、股骨的骨髓腔，沖洗獲得的骨髓細(xì)胞懸液以2 500 r/min離心30 min，后可觀察到離心管內(nèi)液體分為3層：底層為紅細(xì)胞層；中層可觀察到約2～3 mm厚的白膜層，此即為單個(gè)核細(xì)胞層；上層為血清層。將白膜層吸出，PBS洗滌2次，并以1 mL EGM-2 Single Quots培養(yǎng)液定容、混勻，制成母液。以每孔5×106個(gè)的細(xì)胞量接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中，并置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2免疫熒光法鑒定小鼠EPCs 取培養(yǎng)至第21天的EPCs，接種細(xì)胞于纖維連接蛋白包被的載玻片上。21 d后取出載玻片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，山羊封閉血清30 min， 加入抗DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ抗體(1 ∶100)于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，PBS漂洗3次，加入羊抗大鼠IgG-FITC(1 ∶200)及羊抗兔IgG-PE(1 ∶500)，常溫下孵育1 h。PBS漂洗2遍后，以10%緩沖甘油封片。于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ的表達(dá)情況。

3.3實(shí)驗(yàn)分組 分別采用pH 7.4，7.0，6.8，6.4和6.2的培養(yǎng)基處理EPCs 24 h，后用Western blot和real-time PCR分析OGR1的蛋白和mRNA表達(dá)；并分析OGR1在酸性環(huán)境中對(duì)EPCs的活力、遷移和成管能力的影響，分為pH 7.4對(duì)照(control)組、pH 6.4組、pH 6.4+干擾序列對(duì)照(control small interfering RNA, control-siRNA)組和pH 6.4+OGR1-siRNA組，處理時(shí)間為24 h。

3.4RT-PCR和real-time PCR實(shí)驗(yàn) 按試劑盒說(shuō)明操作，用TRIzol 提取總RNA，無(wú)RNA酶活性的DNA 酶消化以降解基因組DNA，酚仿抽提純化，電泳檢測(cè)完整性，RNA濃度測(cè)試后置于-70 ℃冰箱保存。后各取2 μg 總RNA和Oligo (dT) 16 (10 pmol/L) 1 μL，用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入ASICs特異性引物，引物由上海生工生物公司合成，見表1。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s, 58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。結(jié)果以2-ΔΔCt法分析。對(duì)于RT-PCR實(shí)驗(yàn)，取6 μL PCR產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer 混合，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

表1 RT-PCR 引物序列

3.5Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞的總蛋白樣品經(jīng)Larry 法定量，取50 μg 蛋白上樣，行15 % 的SDS-PAGE(100 V，1.5 h)。待溴酚藍(lán)進(jìn)入凝膠底部后，把蛋白質(zhì)再印跡到硝酸纖維素膜上，分別用抗OGRI和β-actin抗體孵育過(guò)夜，后加入用堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng) II 抗，顯色劑顯色，凝膠成像分析。

3.6OGR1-siNRA的轉(zhuǎn)染 OGR1-siRNA的設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[1]，正義序列為5′-UAGAAAGCAAGCCAGGAAGAUGACC-3′，非特異性的非靶向control-siRNA作為對(duì)照。OGR1-siRNA和control-siRNA均由上海吉瑪公司合成。EPCs經(jīng)胰酶消化重懸后計(jì)數(shù)，在6孔板中鋪板，每孔加入2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)進(jìn)行，具體轉(zhuǎn)染方法依據(jù)Invitrogen的操作手冊(cè)。轉(zhuǎn)染后48 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)的處理方法進(jìn)行干預(yù)。轉(zhuǎn)染后，提取細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測(cè)分析轉(zhuǎn)染效果。

3.7CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 在96孔板每孔鋪5 000個(gè)細(xì)胞，EPCs按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理24 h后，將培養(yǎng)基更換成100 μL新鮮的培養(yǎng)基，然后在每孔中加入10 μL的CCK-8試劑，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后在酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量并讀取吸光度(A)值。

3.8流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布 EPCs按照實(shí)驗(yàn)分組處理后，用胰蛋白酶消化各組細(xì)胞并重懸于70%乙醇中，將細(xì)胞在-20 ℃中培養(yǎng)過(guò)夜。然后將固定的細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入含40 mg/L的PI和200 mg/ mL 的RNase A的碘化丙啶染色液，避光在37 ℃中孵育30 min。DNA含量用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，BD Biosciences)和細(xì)胞周期分布由FlowJo 7.6.1(Tree Star Inc)測(cè)定。

3.9劃痕實(shí)驗(yàn) 胰酶消化細(xì)胞，并將細(xì)胞均勻接種至6孔板。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，將培養(yǎng)液換成無(wú)FBS培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。每孔用200 μL槍頭比著直尺畫一“十”字形劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。PBS漂洗3次，去除漂浮的細(xì)胞，并加入無(wú)FBS培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下于固定位置取樣并拍照。使用ImageJ軟件測(cè)量細(xì)胞遷移距離。

3.10Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)使用未鋪Matrigel膠的8 μm Transwell小室。Transwell小室下室中加入600 μL含1% FBS的DMEM培養(yǎng)液，胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后去上清，DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度后，在Transwell小室上室加入100 μL細(xì)胞懸液，遷移實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)小室加入的細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè)。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，上室放入4%多聚甲醛中，室溫固定15 min。吸干固定液，將上室放入0.1%的結(jié)晶紫溶液中，室溫染色15 min。顯微鏡下取3個(gè)隨機(jī)高倍視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

3.11成管實(shí)驗(yàn) 按照試劑盒說(shuō)明書配制ECMatrix膠，將配好的ECMartrix膠添加到在4 ℃預(yù)冷的96孔板中，每孔50 μL，4 ℃，1 000 r/min離心10 min，使其平鋪于板底，并去除氣泡，后在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育超過(guò)1 h，放至ECMartrix膠完全凝固。使用EPCs的細(xì)胞懸液(方法同上)，細(xì)胞濃度調(diào)整為(2.5～5)×107/L，每孔加入200 μL[每孔約(5～10)×103個(gè)細(xì)胞]，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組添加不同pH的培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)內(nèi)培養(yǎng)，6 h后在相差顯微鏡下拍照，觀察管腔形成情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，如方差分析的結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再使用SNK-q方法進(jìn)行各組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定

原代培養(yǎng)的骨髓源性EPCs呈圓形，形態(tài)飽滿，折光性好；培養(yǎng)2 d后的內(nèi)皮祖細(xì)胞開始貼壁，形態(tài)變?yōu)槎趟鬆睿? d 后開始增殖，體積增大。用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色法鑒定分化中的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下，DiI標(biāo)記的ac-LDL為紅色熒光，而FITC標(biāo)記的UEA-Ⅰ為綠色熒光，紅、綠熒光雙染的細(xì)胞即為EPCs，見圖1。

Figure 1.The EPCs were stained with DiI-Ac-LDL and FITC-UEA-Ⅰ.

圖1 EPCs攝取DiI-Ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ的雙熒光染色鑒定

2 OGR1在EPCs的表達(dá)

提取EPCs總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR檢測(cè)，以肝作為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)EPCs中質(zhì)子感知受體OGR1、G2A、GPR4和TDAG8的mRNA均有表達(dá)，其中OGR1和TDAG8表達(dá)最高，見圖2A。而采用real-time PCR并以O(shè)GR1為對(duì)照組后分析發(fā)現(xiàn)，EPCs中G2A和GPR4的mRNA含量明顯低于OGR1(P<0.05)，見圖2B。為進(jìn)一步證實(shí)OGR1在EPCs的表達(dá)，根據(jù)real-time PCR結(jié)果，分別提取EPCs的總蛋白，采用Western blot的方法檢測(cè)OGR1的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明EPCs中有OGR1的蛋白表達(dá)，見圖2C。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，F(xiàn)ITC配體熒光檢測(cè)可見EPCs細(xì)胞膜有明顯藍(lán)色免疫熒光，OGR1在細(xì)胞膜中有表達(dá)，見圖2D。

3 酸性環(huán)境促進(jìn)OGR1在EPCs上的高表達(dá)

為分析酸性環(huán)境對(duì)EPCs上OGR1表達(dá)的影響，用不同pH的培養(yǎng)基處理EPCs 24 h，Western blot分析OGR1的表達(dá)是否隨著pH值而改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外環(huán)境的pH值從7.4到6.4逐漸下降過(guò)程中，OGR1表達(dá)逐漸升高，而pH達(dá)6.2時(shí)OGR1表達(dá)卻反而下降(P<0.05)，見圖3A。Real-time PCR結(jié)果與Western blot的結(jié)果相似，pH 6.4處理后EPCs中OGR1的表達(dá)比對(duì)照組明顯升高，而pH 6.2處理后EPCs中OGR1的表達(dá)比pH 6.4處理后更低(P<0.05)，見圖3B，說(shuō)明酸性環(huán)境可以明顯促進(jìn)OGR1的表達(dá)，因此后續(xù)研究使用pH 6.4的培養(yǎng)基作為處理EPCs的酸性環(huán)境。

4 OGR1介導(dǎo)酸對(duì)EPCs細(xì)胞活力的抑制作用

RNAi方法敲減OGR1的表達(dá)，進(jìn)一步分析OGR1在EPCs中的作用。Western blot發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染control-siRNA的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染OGR1-siRNA 48 h后細(xì)胞中的OGR1表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見圖4A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH 6.4的培養(yǎng)基明顯抑制EPCs的細(xì)胞活力，但是敲減OGR1表達(dá)后卻可以明顯逆轉(zhuǎn)酸性環(huán)境對(duì)EPCs的作用，證實(shí)OGR1可能介導(dǎo)了酸對(duì)EPCs細(xì)胞活力的抑制作用(P<0.05)，見圖4B。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在pH 6.4的培養(yǎng)基中，處于G0/G1期細(xì)胞的百分率明顯升高，而S+G2/M期細(xì)胞的百分率卻明顯下降，說(shuō)明酸性環(huán)境可以導(dǎo)致EPCs的生長(zhǎng)停滯;然而敲減OGR1表達(dá)后G0/G1期細(xì)胞的百分率下降,而S+G2/M期細(xì)胞的百分率上升(P<0.05),見圖4C，因此OGR可能介導(dǎo)酸對(duì)EPCs生長(zhǎng)周期的作用。

Figure 2.The expression of OGR1 in the EPCs. A: RT-PCR was used to detect the mRNA expression of proton-sensing receptor. The liver tissue was used as positive control; B:the mRNA expression of proton-sensing receptor expression was detected by real-time PCR; C: Western blot was used to determine the protein expression of OGR1; D: immunofluorescence staining was used to detect the OGR1 expression in the EPCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsOGR1 group.

圖2 OGR1在EPCs的表達(dá)

Figure 3.The effect of acid medium on the expression of OGR1 in the EPCs. A: the results of Western blot for determining the protein expression of OGR1 in the EPCs; B: the result of real-time PCR for detecting the mRNA expression of OGR1. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs7.4 group;#P<0.05vspH 6.4 group.

圖3 酸性環(huán)境培養(yǎng)基對(duì)EPCs中OGR1表達(dá)的影響

5 OGR1介導(dǎo)酸性環(huán)境對(duì)EPCs的遷移和成管能力的抑制作用

最后通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)以及成管實(shí)驗(yàn)分析酸性環(huán)境對(duì)EPCs的遷移和成管能力以及OGR1在其中的作用。劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH 6.4的培養(yǎng)基明顯抑制EPCs的遷移，但是敲減OGR1的表達(dá)后可以部分逆轉(zhuǎn)上述作用(P<0.05)，見圖5A，這說(shuō)明OGR1可能介導(dǎo)了酸性環(huán)境對(duì)EPCs遷移的抑制作用；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似，進(jìn)一步證實(shí)了OGR1在酸性環(huán)境抑制EPCs遷移中的作用，見圖5B；成管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境明顯抑制EPCs的成管能力，但是敲減OGR1表達(dá)后EPCs的成管能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見圖5C，這說(shuō)明OGR1可能介導(dǎo)了酸性環(huán)境對(duì)EPCs成管能力的抑制作用。

Figure 4.The involvement of OGR1 expression in the inhibitory effects of acidic environment on the viability and the cell cycle distribution of EPCs. A:the results of Western blot for determining the protein level of OGR1 in the EPCs after transfection; B:the result of CCK-8 assay for detecting the cell viability; C:the quantification of cell cycle distribution was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=6.△P<0.05vscontrol-siRNA group;*P<0.05vspH 7.4 group;#P<0.05vspH 6.4+control-siRNA group.

圖4 OGR1介導(dǎo)酸性環(huán)境對(duì)EPCs活力和周期分布的影響

討 論

局部微循環(huán)的受損和功能失調(diào)被認(rèn)為是ANFH的始動(dòng)因素，而血管的自我修復(fù)往往對(duì)最終的骨壞死和骨塌具有重要作用[10]。骨修復(fù)的有效性依賴于血管損傷的程度和側(cè)枝血管的建立。因此，既往對(duì)于ANFH的研究主要著眼于血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變[11]，但是近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)骨髓源性EPCs相較于成熟的內(nèi)皮細(xì)胞更多地參與血管化的過(guò)程以及血管的修復(fù)[12]。

EPCs主要來(lái)源于骨髓，是一種能直接分化為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，具有促進(jìn)新生血管形成及提高微血管密度、促進(jìn)內(nèi)皮再生和提高血管通暢率等作用；其不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也在成體血管新生及維持血管穩(wěn)定中起著重要的作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)富含EPCs的細(xì)胞系也能向成骨定向分化[13]。而且，越來(lái)越多的研究聚焦于骨骼損傷和骨修復(fù)中，提升EPCs水平能有助于血管新生，并利于新骨的形成，且在骨骼損傷或骨骼牽引術(shù)中，均可動(dòng)員骨髓的EPCs釋放到血液循環(huán)，并促進(jìn)血管新生，從而達(dá)到骨修復(fù)和骨愈合[14]。EPCs作為骨再生修復(fù)醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)很大程度上取決于骨骼發(fā)育的細(xì)胞水平，血管新生與新生骨互相促進(jìn)。最近的研究發(fā)現(xiàn)股骨頭缺血性壞死患者的循環(huán)EPCs數(shù)目和功能都顯著降低[4, 10]，這些都強(qiáng)烈提示EPCs功能失調(diào)可能是股骨頭缺血性壞死發(fā)病機(jī)制的始動(dòng)因素和中心環(huán)節(jié)及治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本課題使用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-l雙熒光染色法成功鑒定了內(nèi)皮祖細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

已證實(shí)質(zhì)子感知受體OGR1在哮喘等炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，而缺血性壞死與炎癥酸化具有相似病理基礎(chǔ)，那么EPCs中是否有OGR1的表達(dá)？本研究中利用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)OGR1在EPCs中mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步用Western blot也證實(shí)OGR1蛋白的存在。OGR1在EPCs中的研究有助于我們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，尤其是病變組織酸化常常與病理變化呈現(xiàn)一定程度的相關(guān)性。

Figure 5.The involvement of OGR1 expression in the inhibitory effect of acidic environment on the migration and tube formation ability of EPCs. A: scratch wound-healing assay was conducted in the EPCs with indicated treatment;B:Transwell migration assay was conducted in the EPCs with indicated treatment; C:the representative results of tube structure formation in cultured EPCs.Mean±SD.n=6.*P<0.05vspH 7.4 group,#P<0.05vspH 6.4+ control-siRNA group.

圖5 OGR1介導(dǎo)酸性環(huán)境對(duì)EPCs的遷移和成管能力的抑制作用

各種因素引起的股骨頭血供少、血管網(wǎng)受壓或流出靜脈阻塞引起的局部血供障礙，導(dǎo)致股骨頭乳酸濃度升高，質(zhì)子增加從而成為酸性微環(huán)境[4]，但是酸化的環(huán)境對(duì)EPCs的作用以及其中的具體機(jī)制仍然未知。OGR1是一種酸環(huán)境的感知受體，屬于質(zhì)子感知受體的一員。最近發(fā)現(xiàn)的質(zhì)子感知受體包括OGR1，G蛋白偶聯(lián)受體G2A(G2 accumulation)，T 細(xì)胞死亡相關(guān)基因8(T cell death-associated gene 8，TDAG8)和G 蛋白偶聯(lián)受體4(G-protein-coupled receptor 4，GPR4)[15]，這些受體均是卵巢癌G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCR)亞家族成員，GPCR介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的傳遞作用，并參與一些病理生理過(guò)程[16]。

GPCR亞家族在體內(nèi)分布廣泛，其中OGR1因在破骨細(xì)胞表達(dá)且介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放被關(guān)注[16]。細(xì)胞外酸性環(huán)境能誘導(dǎo)終板軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞Ca2+的水平迅速升高。用OGR1 的拮抗劑處理細(xì)胞，或用siRNA 抑制OGR1表達(dá)時(shí)，此效應(yīng)被減弱，這證實(shí)OGR1可能介導(dǎo)了酸性環(huán)境對(duì)細(xì)胞作用，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并調(diào)控細(xì)胞功能[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot及real-time PCR首次證實(shí)酸性環(huán)境誘導(dǎo)EPCs上的OGR1高表達(dá)，并且pH 6.4的培養(yǎng)基中OGR1表達(dá)最高，并以此作為下一步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

不同的微環(huán)境對(duì)EPCs的增殖和成管能力可以產(chǎn)生不同的影響。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)低氧微環(huán)境可以促進(jìn)人EPCs增殖、遷移和成管能力，并且線粒體分裂及相關(guān)的信號(hào)通路參與其中。但是Wu等[19]發(fā)現(xiàn)在高糖和低氧的微環(huán)境卻可以抑制大鼠骨髓源性EPCs增殖、遷移和成管能力，并促進(jìn)EPC的凋亡。而本課題通過(guò)Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)和成管實(shí)驗(yàn)等證實(shí)pH 6.4的酸環(huán)境抑制EPCs的活力、遷移和成管能力。更重要的是，我們通過(guò)siRNA沉默OGR1后證實(shí)OGR1可能介導(dǎo)了酸性環(huán)境對(duì)EPCs的作用，但是具體的OGR1下游的信號(hào)機(jī)制上需要進(jìn)一步研究。

結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境促進(jìn)小鼠骨髓來(lái)源EPCs高表達(dá)OGR1，然而酸性環(huán)境卻抑制EPCs生長(zhǎng)、遷移和成管能力，敲減OGR1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)酸性環(huán)境對(duì)EPCs的作用，因此OGR1可能介導(dǎo)了酸性環(huán)境對(duì)EPCs生物學(xué)功能的抑制作用。OGR1在EPCs表達(dá)及作用有望為ANFH防治研究開辟新的突破點(diǎn)。