龍巖市239株沙門菌毒力基因檢測結(jié)果分析

曹春遠(yuǎn)，陳前進(jìn)，陳小東，鐘葉平，李美華，陳海濱

沙門菌是最重要的人獸共患傳染性疾病的病原菌之一，大多數(shù)有很強(qiáng)的致病力，對人類健康和禽畜養(yǎng)殖業(yè)造成重大危害，并且是最重要的人類食源性致病菌之一，是目前的重大公共衛(wèi)生問題之一。研究表明沙門菌致病主要是因?yàn)榇罅慷玖σ蜃酉嗷プ饔脤?dǎo)致[1]，毒力相關(guān)的基因因此成為近年研究的重點(diǎn)。毒力基因作為沙門菌致病特性的遺傳物質(zhì)，也長期在發(fā)生著變遷進(jìn)化。為了解龍巖市沙門菌毒力基因攜帶與變遷情況，本文收集了1991-2017年間239株沙門菌進(jìn)行9種毒力基因檢測分析，為龍巖市沙門菌病的防制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 收集1991-2017年239株沙門菌。其中，179株分離自人體樣本(主要從本市綜合醫(yī)院臨床病人糞便樣本分離，少部分分離自飲食從業(yè)人員肛拭樣本)，60株分離自禽畜肉等食品監(jiān)測樣本。

1.1.2主要儀器與試劑 VITEK 2 Compact(法國梅里埃)，PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra)，三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠)，凝膠成像儀(法國)。泰國S&A公司沙門菌分型血清，premix、100 bp MARKER為TAKARA產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1菌株復(fù)核鑒定 用VITEK 2 Compact GN鑒定卡進(jìn)行復(fù)核鑒定。血清分型參照Kauffman- White標(biāo)準(zhǔn),其中鞭毛誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)參照GB 4789.5-2016方法。

1.2.2毒力基因檢測 用PCR方法檢測沙門菌9個毒力基因的片段，包括：sopB、invA、sifA、sscA、sseE、spvB、pefA、spvR、spvC等，引物序列與擴(kuò)增程序和體系配制參考文獻(xiàn)[2-3]，見表1。引物序列由上海生工合成。核酸提取應(yīng)用水煮沸法。

表1 9個毒力基因片段檢測用引物序列
Tab.1 Primer sequences for detection of 9 virulence gene fragments

引物名稱位置引物序列5′-3′擴(kuò)增片段長度來自文獻(xiàn)invASPI-1F:TATCGCCACGTTCGGGCAATCTTR:TCGCACCGTCAAAGGAACCACT275[2]sopBSPI-1F:GGACCGCCCAGCAACAAAACAAGAAGAAGR:AGTGATGCCCGTTATGCGTCAGTGTATT220[2]sifASPI-2F:TTTGCCGAACGCGCCCCCACACGR:GTTGCCTTTTCTTGCGCTTTCCACCCATCT449[2]sscASPI-2F:ATGAAAAAAGACCCGACCTAR:TTAGCTCCTGTCAGAAAGTT474[3]sseESPI-2F:ATGGTGCAAGAAATAGAGCAR:TTAAAAACGTCGCTGGATAA417[3]spvB毒力質(zhì)粒F:GGTTACTGCATGACAGTAACGGCR:CGCAAAGCTTGTTCAGTATCGG561[2]pefA毒力質(zhì)粒F:GCGCCGCTCAGCCGAACCAGR:CAGCAGAAGCCCAGGAAACAGTG157[2]spvR毒力質(zhì)粒F:AGGAAATCGGACCTACGGR:TAACATCGCCAGCCCTTG473[3]spvC毒力質(zhì)粒F:AAGGTCGTTCAACAAGCCR:CATTTCACCACCATCACG252[3]

1.3數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用EXCEL2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1菌株復(fù)核鑒定結(jié)果 所有239株待檢菌株經(jīng)VITEK 2 Compact GN鑒定卡復(fù)核鑒定，均提示為沙門菌。經(jīng)血清復(fù)核鑒定，結(jié)果為：腸炎沙門菌91株、鼠傷寒沙門菌58株，這2種血清型沙門菌占了62.3%(149/239)，其余詳見表2。

2.2各種毒力基因片段檢出情況 239株沙門菌均檢出invA和sopB，檢出率為100%(239/239)；237株檢出sseE，檢出率為99.2%(237/239)；227株檢出sscA，檢出率為95.0%(227/239)；204株檢出sifA，檢出率為85.4%(204/239)；170株檢出spvC，檢出率為71.1%(170/239)；pefA、spvB、spvR等3種基因均有111株菌檢出，檢出率為46.4%(111/239)。

2.3毒力基因片段陽性檢出數(shù)及結(jié)果模式 239株沙門菌中，共檢出毒力基因1 649個，平均每菌株檢出毒力基因6.9種。其中，95株檢出全部9種毒力基因，占39.8%(95/239)；67株檢出5種毒力基因，占28.0%(67/239)；44株檢出6種毒力基因，占18.4%(44/239)；此3類合計為86.2%。根據(jù)不同毒力基因片段的陽性檢出結(jié)果不同，可得到不同的陽性檢出結(jié)果模式，而不同血清型沙門菌主要檢出的毒力基因片段的模式也不同。檢測菌株數(shù)較多的腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌、都柏林沙門菌的毒力基因陽性檢出結(jié)果共有13種模式(詳見表3)。其中，腸炎沙門菌以模式1(即檢出全部9種毒力基因)為主，有76株，占83.5%(76/91)；鼠傷寒沙門菌以模式12、模式10(invA、sopB、sseE、sscA、sifA等5種毒力基因陽性，spvB、spvR、pefA等3種毒力基因陰性，spvC陰性或陽性)為主，共45株，占77.6%(45/58)；斯坦利沙門菌也是以模式10、模式12為主，共8株，占66.7%(8/12)；都柏林沙門菌以模式1為主，有3株，占37.5%(3/8)?？梢?，在這4種常見血清型沙門菌中，模式1、模式10、模式12是比較主要的毒力基因陽性結(jié)果模式。

表2 龍巖市不同血清型沙門菌毒力基因檢出情況
Tab.2 Virulence gene detection of different serotypes ofSalmonellain Longyan City

沙門菌血清型名稱菌株數(shù)invAsopBsseEsscAsifAspvCspvBspvRpefA毒力基因數(shù)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)陽性菌株數(shù)(%)總數(shù)每菌株平均數(shù)腸炎91911009110091100911008087.9 8694.5 8795.6 8795.6 8087.9 7848.6 鼠傷寒58581005810058100581005798.3 3255.2 1017.2 1119.0 1220.7 3546.1 斯坦利12121001210012100121001083.3 975.0 18.3 18.3 216.7 715.9 都柏林88100810081008100787.5 675.0 675.0 562.5 450.0 607.5 紐波特5510051005100510051005100000000306.0 乙型副傷寒551005100510051005100360.0 000000285.6 德爾卑44100410041004100375.0 125.0 000000205.0 里森331003100310031003100133.3 000000165.3 傷寒221002100210021002100210021002100150.0 178.5 豬霍亂2210021002100210021002100000000126.0 阿貢納111001100110011001100110000000066.0 海德爾堡111001100110011001100110000000066.0 雞111001100110011001100110011001100110099.0 科特布斯1110011001100110011000000000055.0 魯齊齊1110011001100110011000000000055.0 倫敦111001100110011001100110000000066.0 明斯特1110011001100110011000000000055.0 山夫登堡1110011001100110000.0 0000000044.0 圣保羅1110011001100110011000000000055.0 印第安納1110011001100110011000000000055.0 未分型3939100391003794.92769.22153.8 1948.7410.3410.31128.22015.2合計23923910023910023799.222795.020485.417071.111146.411146.411146.416496.9

表3 腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌、都柏林沙門菌各毒力基因陽性檢出結(jié)果模式
Tab.3 Virulence gene positive detection patterns ofS.enteritidis,S.typhimurium,S.stanleyandS.dublin

模式invAsopBsseEsscAsifAspvCspvBspvRpefA腸炎沙門菌鼠傷寒沙門菌斯坦利沙門菌都柏林沙門菌1+++++++++7610132+++++-+++10003++++-++++20004++++++-++01005+++++++-+00016++++++++-00027++++--+++10008++++-+++-70009++++++--+011010++++++---0205011++++-+---102012+++++----3253113++++-----0101

注：“+”表示陽性檢出，“-”表示未檢出。

2.5不同年代沙門菌毒力基因陽性檢出菌株數(shù)比較 由于invA、sopB等2種毒力基因的檢出率均為100%，所以在所有年代都無差異；sseE、spvC在不同年代間也沒有差異，顯示了較好的穩(wěn)定性；而sifA、spvC、spvB、spvR、pefA等5種毒力基因在不同年代沙門菌中最少檢出數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明龍巖沙門菌攜帶這5種毒力基因的菌株數(shù)量隨著時間的進(jìn)程而增加，詳見表4。

表4 龍巖市不同年代沙門菌9種毒力基因陽性檢出菌株數(shù)比較
Tab.4 Comparison of nine virulence gene positive strains ofSalmonellain Longyan in different years

年代檢測菌株數(shù)invAsopBsseEsscAsifAspvCspvBspvRpefA1991-20001111111111100082001-2010424242414136271212132011-2017186186186185185167133999990趨勢卡方值(χ2)///1.5095.9431.993.0718.2618.267.39P值///=0.5<0.001<0.0010.2<0.001<0.001=0.025

2.6人體樣本和食品樣本分離株毒力基因陽性檢出數(shù)比較 人體樣本分離的沙門菌以檢出9種、5種、6種毒力基因的菌株為主，共157份，占87.8%，食品樣本分離的沙門菌以檢出9種、5種毒力基因的菌株為主，共45株，占75%，均明顯高于攜帶其它毒力基因種數(shù)的菌株。但兩類不同來源沙門菌毒力基因陽性檢出菌株數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.7，P=0.998)。見表5。

表5 不同來源沙門菌不同種類數(shù)毒力基因陽性檢出菌株數(shù)比較
Tab.5 Comparison of virulence gene positive strains ofSalmonellafrom different sources

毒力基因種類數(shù)陽性菌株數(shù)人源(n=179)食源(n=60)96728550176404775473862211310卡方檢驗(yàn)χ2=0.7,P=0.998

3 討 論

沙門菌是與人類關(guān)系最密切的致病菌，可引起食物中毒，以及胃腸炎、菌血癥或敗血癥、腸熱癥等多種疾病。本研究結(jié)果表明，龍巖市沙門菌感染以腸炎沙門菌與鼠傷寒沙門菌為主，共占62.3%(149/239)。毒力是沙門菌致病的根本原因，是由分布于其中的許多毒力基因相互作用而產(chǎn)生的。沙門菌毒力基因主要由染色體上的毒力島(Salmonella pathogenicity island，SPI)編碼，少數(shù)由毒力質(zhì)粒(plasmid)編碼[4]。

目前已發(fā)現(xiàn)的SPI有SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5等20多個[5]。其中SPI1遺傳性穩(wěn)定，是沙門菌入侵宿主非吞噬細(xì)胞所必需的，在侵襲巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，幾乎所有沙門菌血清型都具有[6]。SPI2主要控制沙門菌在吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，使其逃避巨噬細(xì)胞輔酶依賴的殺傷作用。SPI2編碼與系統(tǒng)感染有關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)，主要有sse、ssc、ssa和ssr等基因。其中，sse編碼分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，ssc編碼分子伴侶，ssa編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)成分，ssr編碼分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)子[3]。所以，本研究重點(diǎn)選擇SPI1中的invA與sopB毒力基因，SPI2中的sifA、sseE、sscA毒力基因進(jìn)行研究。

invA是沙門菌屬特異性基因[7]，是主要毒力因子，決定沙門菌的侵襲力，與其致病性密切相關(guān)[8]。sopB基因編碼參與腸黏膜液體分泌和炎癥反應(yīng)的相關(guān)蛋白。invA與sopB這2種基因都是SPI標(biāo)志性基因[9]，在本研究中，其檢出率均為100%，與楊勁松(福建省臨床腸炎沙門菌)[2]、夏賓雁(四川山羊源沙門菌)[10]、孫璐(山東肉雞屠宰生產(chǎn)鏈中沙門菌)[11]研究結(jié)果一致，與彭斌[12]從新疆零售牛肉中沙門菌的研究結(jié)果相比，invA的檢測結(jié)果一致，而sopB檢出卻相差很大(7.1%)，這是否與沙門菌分離的地域或物種有關(guān)尚待研究。SPI2中的3種毒力基因檢出率都在85%以上。曹恬雪等研究表明攜帶SPI1+SPI2與沙門菌的致病性呈正相關(guān)[13]，研究表明龍巖市沙門菌的毒力較強(qiáng)。

在沙門菌的毒力質(zhì)粒中，spv(Salmonella plasmid virulence genes)是最重要的毒力質(zhì)粒，包括spvA、spvB、spvC、spvD、spvR、pefA等基因，有助于提升沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的粘附能力、存活時間及繁殖能力等，從而提升其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存能力[14]。spv表現(xiàn)為細(xì)胞毒性，與腸系膜淋巴結(jié)、脾、肝等腸道外組織感染有關(guān)[3]。pefA基因是菌毛操縱子基因，在感染階段發(fā)揮重要作用，通過伴侶誘導(dǎo)的裝配途徑調(diào)節(jié)細(xì)菌對腸上皮細(xì)胞的粘附[15]。pefA、spvC基因是沙門菌毒力質(zhì)粒上特有的標(biāo)志性基因[1,9]。

毒力質(zhì)粒的攜帶與特定的血清型有關(guān)，目前已報道的攜帶毒力質(zhì)粒的沙門菌血清型有11種，包括鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、腸炎沙門菌、都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、雞沙門菌、布利丹沙門菌、御成門沙門菌、阿貢納沙門菌、S.sendai、S.abortusovis[10]。本研究中，不僅從腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、豬霍亂沙門菌、阿貢納沙門菌、雞沙門菌中檢出spvC，還從倫敦沙門菌、斯坦利沙門菌、紐波特沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌、里森沙門菌、傷寒沙門菌、海德爾堡沙門菌等8種血清型沙門菌中檢出spvC，但僅從腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、都柏林沙門菌、雞沙門菌、斯坦利沙門菌、傷寒沙門菌中檢出pefA。這可能與樣品來源及地域差異有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

本研究中，腸炎沙門菌4種質(zhì)粒毒力基因的檢出率均在87%以上，與鼠傷寒沙門菌的陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其它血清型沙門菌由于菌株數(shù)較少，有待收集到更多菌株后再作進(jìn)一步比較分析。

本研究中沙門菌spvC檢出率為71.1%，其中腸炎沙門菌spvC陽性檢出率更是高達(dá)94.5%：分離自人體樣本的63株腸炎沙門菌58株檢出spvC，陽性率為92.1%(58/63)，分離自食品樣本的28株腸炎沙門菌均檢出spvC，陽性率100%，沒有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.07，P=0.3)。龍巖市spvC的檢出率高于莊孝飛2008-2012年上海(食源性+醫(yī)源性)腸炎沙門菌分離株中spvC的檢出率(78.9%)[1]、遠(yuǎn)高于夏賓雁山羊源沙門菌spvC的陽性檢出率(47.6%)[10]和張芬2006-2013年間于寧波地區(qū)沙門菌中spvC的檢出率(21.9%)[16]，更有甚者，彭斌在新疆零售牛肉中分離的沙門菌中未檢出spvC[12]。表明龍巖市沙門菌特別是腸炎沙門菌spvC毒力基因攜帶率高于全國各地的水平，同時由于龍巖市沙門菌spvC毒力基因在不同年代間相對穩(wěn)定，那么這種差異可能與各種血清型沙門菌構(gòu)成不同、地域不同、來源物種不同有關(guān)，有待進(jìn)一步研究分析。

本研究結(jié)果還顯示，龍巖市沙門菌除invA、sopB、sseE、spvC等4種毒力基因陽性檢出數(shù)量隨著時間的進(jìn)程相對穩(wěn)定外，其余5種毒力基因特別是質(zhì)粒毒力基因的陽性檢出數(shù)隨時間進(jìn)程呈現(xiàn)顯著性增加，表明龍巖市沙門菌質(zhì)粒毒力基因有累積增強(qiáng)趨勢，這一方面主要與質(zhì)粒本身的特性有關(guān)：質(zhì)粒存在于細(xì)菌細(xì)胞漿中，獨(dú)立于染色體而存在，是細(xì)菌重要的遺傳物質(zhì)，可提高細(xì)菌選擇有利生存條件的能力，使細(xì)菌在特殊的環(huán)境下生存和生長，并且通過在種內(nèi)、種間甚至屬間進(jìn)行DNA交換轉(zhuǎn)移使其生存能力不斷因進(jìn)化而增強(qiáng)，并同時實(shí)現(xiàn)毒力基因的累積增強(qiáng)；另一方面也可能這些毒力基因是以轉(zhuǎn)座子等其它因子形式存在于菌體內(nèi)的，進(jìn)而增強(qiáng)了菌株的毒力。

根據(jù)劉芳萍[17]、黃瑞[18]等的研究結(jié)果，攜帶毒力基因較多的菌株致病性也較強(qiáng)，特別是攜帶spvC基因的菌株大多數(shù)表現(xiàn)為強(qiáng)致病性。本次研究的9種毒力基因在龍巖市沙門菌的檢出率均高于45%，平均每菌株檢出毒力基因數(shù)為6.9種，檢出毒力基因達(dá)5種以上的菌株數(shù)共226株，占94.56%。所有菌株均檢出invA、sopB2種SPI1毒力基因，絕大部分菌株檢出SPI2毒力基因中的sseE、sscA、sifA，超過70%菌株檢出spvC，spvB、spvR、pefA陽性檢出率均為46.4%。其中腸炎沙門菌以檢出全部9種毒力基因?yàn)橹?，?3.5%(76/91)；鼠傷寒沙門菌以invA、sopB、sseE、sscA、sifA陽性，spvB、spvR、pefA陰性結(jié)果多見，占77.6%(45/58)。結(jié)果表明龍巖市沙門菌攜帶較多的毒力基因，臻病性較強(qiáng)。本研究結(jié)果還顯示食源性與人源性分離株攜帶毒力基因無顯著性差異，表明龍巖市食源性與人源性沙門菌交叉污染/感染特別嚴(yán)重，應(yīng)同步加強(qiáng)人、禽、畜沙門菌病的監(jiān)測與管理。

利益沖突：無