杭州地區(qū)相同分子型別的單核細胞增生李斯特菌臨床和食品分離株基因組分析

俞 驊，董華麗，汪皓秋，樓秀芹，劉 濤，張 蔚，王旭初，潘勁草

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是一種常見的食源性致病菌，在肉、蔬菜、水果、冷凍飲品等食品中均能檢出，可引起人畜疾病。免疫力低下者攝入該菌會引起李斯特菌病，癥狀主要為腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等，嚴重的可以造成死亡。李斯特菌病平均潛伏期為2～3周，最長可超過70 d[1-2]。一旦發(fā)病，特別是散發(fā)病例，進行食物來源溯源非常困難。近年來在歐美發(fā)達國家造成多起由其引起的食物中毒嚴重暴發(fā)事件，死亡率甚至可達20%～30%[3]。而在國內(nèi)散發(fā)病例(如造成孕產(chǎn)婦流產(chǎn))較為常見[4]。

引起李斯特菌病的血清型主要是1/2a、1/2b和4b，分子分型和溯源一般采用脈沖場凝膠電泳(Pulse-field gel electrophoresis，PFGE)。但傳統(tǒng)的分子分型方法受限于分析位點限制，分辨力有限。隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，基于細菌核心基因組或全基因組SNPs位點進行溯源，因其分辨率高、重復(fù)性好，被越來越廣泛使用[5]。本研究對杭州地區(qū)一起食物暴露不明確的李斯特菌病散發(fā)事件的臨床分離株，和流行病學(xué)無關(guān)聯(lián)但具有相同PFGE型別的食品分離株進行了基因組測序，分析基因組序列差異。并與NCBI Assembly公共數(shù)據(jù)庫中相同多位點序列分型(Multi-locus Sequence Typing, MLST)型別的菌株進行基因組SNPs位點進化分析，研究可能的污染食品溯源與傳播途徑。

1 材料與方法

1.1實驗與分析菌株 選擇PFGEApaI和AscI酶切圖譜完全一致(見圖1)的杭州地區(qū)2007-2011年單核細胞增生李斯特菌食品分離株6株和2012年臨床分離株1株(王某，女，22y，中孕，胎死宮內(nèi)，高熱入院，B超宮內(nèi)死胎，分離自血培養(yǎng)需氧厭氧雙瓶培養(yǎng)瓶)。多位點序列分型(Multi-locus sequence typing, MLST)結(jié)果均為ST8型，菌株背景信息參見表1。對NCBI Assembly公共數(shù)據(jù)庫中613株單核細胞增生李斯特菌基因組進行MLST分析，獲得ST8型的基因組。

圖1 7株杭州本地食品與臨床來源ST8型單核細胞增生李斯特菌PFGE分型圖譜，CMCC 54007為參考菌株Fig.1 Seven local food and clinical isolates of ST8 type of Listeria monocytogenes PFGE cluster, CMCC 54007 was the reference strain

1.2DNA提取、基因組測序、質(zhì)控和組裝 采用QIAamp DNA mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司，貨號：51304)提取基因組DNA；采用 Nextera XT DNA文庫構(gòu)建試劑盒(美國illumina公司，型號：FC-131-1024)進行文庫構(gòu)建；基因組測序應(yīng)用illumina Miseq平臺，使用Miseq Reagent Kit v3試劑盒(美國illumina公司，型號：MS-102-3003)。以上操作均按試劑盒說明書進行。對測序reads使用FastQC[6]驗證測序質(zhì)量，用Trimmomatic[7]去除接頭序列。使用shovill[8]和Spades[9]進行基因組拼接?；蚪M拼接序列使用Quast[10]驗證質(zhì)量。

1.3毒力基因、ncRNA鑒定和質(zhì)粒掃描 基因組測序短序列使用srst2[11]，拼接序列使用MLST[12]工具掃描獲得ST型別；用Prokka[13]注釋拼接基因組，使用Infernal[14]以Rfam[15]為數(shù)據(jù)庫鑒定ncRNAs。VFDB(http://www.mgc.ac.cn/VFs)數(shù)據(jù)庫中66個單核細胞增生李斯特菌毒力基因做為鑒定數(shù)據(jù)庫，用blastn掃描基因組毒力基因。對本地菌株的基因組拼接序列提交到NCBI blast進行比對，鑒定是否攜帶已知質(zhì)粒。

1.4基因組共線性和SNPs分析 用Sibelia[16]將杭州本地臨床分離株12-103基因組分別與杭州地區(qū)ST8型食品分離株，以及公共數(shù)據(jù)庫中2株臨床來源的基因組完成圖的菌株Lm-N1546,IZSAM_Lm_15_17439_A144和1株臨床來源的基因組草圖的菌株LM05-00401進行共線性比對。以LM05-00401為參考基因組，用Harvest[17]比對獲得ST8型全基因組SNPs序列。使用Gubbins[18]去除重組，RAxML[19]構(gòu)建基于SNPs的最大似然法進化樹(模型采用GTR+G，bootstrap=1 000)，使用ggtree[20]繪制進化樹。

2 結(jié) 果

2.1基因組測序與公共數(shù)據(jù)庫菌株 7株杭州地區(qū)ST8型單核細胞增生李斯特菌基因組測序數(shù)據(jù)及拼接結(jié)果參見表1。采用mlst掃描后，NCBI Assembly公共數(shù)據(jù)庫中613個單核細胞增生李斯特菌基因組中可獲得已知ST型別的有600個，其中有41株ST8型單核細胞增生李斯特菌株，提取這41株ST8型菌株在NCBI Biosample數(shù)據(jù)庫中的背景信息，具體參見表2。

2.2毒力基因、ncRNAs序列和質(zhì)粒分布 毒力基因進行掃描結(jié)果顯示除了Lm-N1546和IZSAM-Lm-15-17439-A144缺失virR基因外，其他ST8型菌株均攜帶毒力基因(表3)。杭州本地菌株中12-103的lmo1136多一個9 bp的重復(fù)序列，12-004和12-015的lmo2396少204 bp的片段。杭州地區(qū)菌株的ncRNAs分子只有rli48、rli62和rliG在分布上有差異。公共數(shù)據(jù)庫中的菌株只有LM66和LM71缺少rli31。12-003和12-004未發(fā)現(xiàn)攜帶質(zhì)粒，其余5株攜帶pLmA144(KU513859)質(zhì)粒。菌株的ncRNAs和質(zhì)粒差異見表3。

2.3基因組共線性和SNPs分析 杭州地區(qū)臨床分離株12-103與6株食品分離株和3株國外臨床分離株大于15 kbp片段的共線性均一致，沒有大片段重組現(xiàn)象(共線性結(jié)果參見圖2)?；蚪MSNPs進化樹結(jié)果杭州地區(qū)分離株與BCW_3902形成一個的分支?？傮w上12-103與杭州食品分離株高度近源(進化樹參見圖3)，12-004與臨床株12-103的進化上最接近，只有16個SNPs差異，相差最多的是24個SNPs位點的12-015。

表1 杭州地區(qū)單核細胞增生李斯特菌分離株及基因組測序結(jié)果
Tab.1L.monocytogenesisolates and genome sequencing results in Hangzhou

StrainSourceYearSerovarMLSTNCBI AccessionGenomeSize(M)N50(bp)CoverageCDS12-003Food, Raw meat, Pork20071/2aST8QKRM002.89298 424245x284312-004Food, Raw meat, Pork20071/2aST8QKRN002.92579 809218x289712-015Food, Raw meat, Chicken20071/2aST8QKRO003.01438 991188x297712-038Food, Frozen meat, Chicken20091/2aST8QKRP003.01440 406251x298112-043Food, Ready to eat, Salad fungus20091/2aST8QKRQ003.01579 981242x297912-052Food, Cooked meat, Beaf20111/2aST8QKRR003.01579 805290x298012-103Human, Blood20121/2aST8QKRL003.01365 122165x2979

表2 NCBI基因組拼接數(shù)據(jù)庫中ST8的菌株基因組
Tab.2 Genomes information of ST8 in NCBI assembly database

StrainNCBI AssemblyGenome LevelsGenome Size(M)Contigs No.DateSerotypeSourceCountryLm N1546GCA_001483445.1complete3.04120111/2abloodSwitzerlandLM70GCA_001487535.1contig2.9641120121/2aunknownItalyLM69GCA_001490875.1contig2.9817520121/2aunknownItalyLM68GCA_001494455.1contig2.9715720121/2aunknownItalyLM66GCA_001497315.1contig2.9721720121/2aunknownItalyLM71GCA_001498715.1contig3.0020120121/2aunknownItalyIZSAM_Lm_15_17439_A144GCA_001513695.1complete2.9112008/7/11/2abloodItalyLM05-00401GCA_001564575.1contig2.922920051/2abloodFranceLM08-01457GCA_001565335.1contig3.012220081/2aunknownunknownMF3949GCA_001586295.1contig3.012120111/2asalmon processing facilityNorwayMF4245GCA_001586305.1contig3.011420111/2asalmon processing facilityNorwayMF5369GCA_001586315.1contig3.011420111/2apoultry processing facilityNorwayMF4077GCA_001586325.1contig3.011420111/2asalmon processing facilityNorwayMF5377GCA_001586375.1contig3.011620131/2apoultry processing facilityNorwayBCW_3902GCA_001761205.1scaffold2.93152006/1/291/2aunknownunknownCFSAN049311GCA_002443405.1scaffold3.002520141/2abloodItalyCFSAN049263GCA_002444035.1scaffold2.922320151/2abloodItalyCFSAN049247GCA_002444235.1scaffold3.042420151/2abloodItalyCFSAN045777GCA_002523295.1scaffold3.03932012/31/2aCooked hamItalyCFSAN045779GCA_002523305.1scaffold3.03602012/31/2aSwab (dairy plant)ItalyCFSAN045775GCA_002523365.1scaffold3.03282012/21/2asalamiItalyCFSAN045772GCA_002523375.1scaffold3.03352012/121/2aFresh sausageItalyCFSAN045769GCA_002523475.1scaffold3.05452012/111/2asalamiItalyCFSAN044784GCA_002524685.1scaffold3.003220041/2apastaItalyCFSAN044783GCA_002524695.1scaffold3.045820041/2afishItalyCFSAN045953GCA_002526485.1scaffold3.05372012/101/2asalamiItalyCFSAN045842GCA_002527555.1scaffold3.00382014/101/2aCured sausageItalyCFSAN045840GCA_002527595.1scaffold3.00382014/91/2aMeat productItalyCFSAN045838GCA_002527635.1scaffold2.92292014/51/2aSmoked salmonItalyCFSAN045826GCA_002527885.1scaffold3.03332013/61/2achickenItalyCFSAN045822GCA_002527945.1scaffold3.00402013/51/2aChicken meatItalyCFSAN045812GCA_002528155.1scaffold2.991042013/41/2asushiItalyCFSAN045804GCA_002528295.1scaffold3.03392013/21/2aChicken saladItalyCFSAN045798GCA_002528425.1scaffold3.00312013/111/2aswabItalyCFSAN045792GCA_002528535.1scaffold3.03522012/91/2asalamiItaly表2(續(xù))

表3 杭州本地分離株主要毒力基因、non-coding RNA、質(zhì)粒分布和SNPs位點差異
Tab.3 Distribution of virulence genes, non-coding RNA, plasmid and SNPs differences in local isolates in Hangzhou

isolatelmo1136bplmo2396bpril48ril62133 bp copy130 bp copyrliGplasmidSNPs Numbers12-0031 6292 415-++missND①2312-0041 6292 211③-+-seedND①1612-0151 6292 211③-++fullpLmA144(KU513859)2412-0381 6292 415+--seedpLmA144(KU513859)2012-0431 6292 415-+-seedpLmA144(KU513859)1812-0521 6292 415---seedpLmA144(KU513859)2312-1031 638②2 415+--seedpLmA144(KU513859)/

注：① ND表示未檢測到(Not detected)。

② 多一段9bp重復(fù)序列5′-gtagatccg-3′。

③ 缺失一段204bp的序列。

圖3 ST8型單核細胞增生李斯特菌基因組SNPs位點進化樹圖Fig.3 Isolates of L. monocytogenes ST8 genomic SNPs phylogenic tree

3 討 論

單核細胞增生李斯特菌由于其潛伏期長的特點，散發(fā)病例難以從流行病學(xué)調(diào)查攝入食品找到污染病原。缺乏流行病學(xué)證據(jù)，可以通過病原細菌溯源“金標(biāo)準” —— PFGE分子分型的方法，以實驗室證據(jù)給現(xiàn)場流行病學(xué)提供判定依據(jù)。但對于一些細菌的特定亞型，PFGE、MLVA等傳統(tǒng)的分子分型技術(shù)存在分辨效果不夠的問題。對于杭州地區(qū)具有相同PFGE型別的臨床分離株與食品分離株要進行溯源分析，則應(yīng)采用如高通量測序技術(shù)這種精度更高的方法，從基因組層面獲得更為全面準確的信息。

研究表明ST8型菌株主要在肉制品或中間加工過程中分離率較高，具有較強的致病潛力,是一類高度克隆化的型別[21]。PFGE帶型相同的食品分離株均來自不同年份不同地區(qū)的生禽、生畜肉，可能這類菌株對肉制品加工流程的環(huán)境適應(yīng)性比較強。對于共線性結(jié)果表明12-103與其他杭州食品分離株和國外臨床分離株在基因組層面沒有出現(xiàn)大片段的重組或丟失等現(xiàn)象，這也與杭州地區(qū)的菌株P(guān)FGE結(jié)果帶型一致相符。對于基因組contigs序列排列是否與國外臨床株一致，還需要通過進一步實驗驗證。單核細胞增生李斯特菌毒力基因攜帶率很高[22]，毒力調(diào)控因子virR基因起重要的調(diào)控作用，但2株臨床分離株(Lm-N1546和IZSAM-Lm-15-17439-A144)卻缺失該調(diào)控因子。有實驗表明缺失virR基因會明顯降低菌株的耐藥性[23]。本研究中不同來源的ST8型菌株毒力基因分布相同，但部分基因序列結(jié)構(gòu)存在差別。與致死pH值環(huán)境中的菌株酸耐受相關(guān)[24-25]的lmo0036基因序列中臨床分離株12-103比其他食品分離株序列多了9 bp的富亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeat)序列(gtagatccg)。lmo2396基因是internalin內(nèi)化素基因，與單核細胞增生李斯特菌靶細胞識別有關(guān)[26]。食品分離株12-004和12-015此基因缺失了一個204 bp的區(qū)域。ncRNA作為一種在轉(zhuǎn)錄階段調(diào)控整個生物體表達的RNA小分子，其快速調(diào)控的特點與細菌環(huán)境適應(yīng)，致病性以及針對宿主免疫應(yīng)答逃逸功能相關(guān)[27]。通過對本地ST8型菌株ncRNA分布掃描，結(jié)果表明ncRNAs分布高度一致，只在調(diào)控功能與細菌基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)的rli48, rli62和rliG這3個A118 prophage類區(qū)域序列[28]位點上有差異。這些序列的差異在臨床株與食品株，以及食品株之間無明顯內(nèi)在規(guī)律。

比較單核細胞增生李斯特菌PFGE和基因組分析的結(jié)果，基于參考基因組的ST8型菌株進化關(guān)系表明，杭州地區(qū)2007-2011年食品分離株與2012年臨床分離株基因組SNPs差異在16～24個之間，基因組核心序列在進化上高度同源。結(jié)合國外分離株的基因組，顯示ST8型核心基因組序列高度保守，因此提示PFGE方法可能不適合應(yīng)用于該型別的分型和溯源。雖然ST8型菌株也存在一些ncRNAs分子和質(zhì)粒分布上的分子差異，這些差異與致病性相關(guān)需要后續(xù)進一步進行研究。

本文針對一例臨床散發(fā)單核細胞增生李斯特菌分離株與PFGE帶型相同的食品分離株進行基因組序列分析，判斷溯源關(guān)系。結(jié)果表明杭州市場近年肉類食品中存在遺傳進化高度相似的一群ST8型單核細胞增生李斯特菌，杭州孕婦的感染非?？赡軄碜赃@群菌株，因此肉制品中ST8型單核細胞增生李斯特菌引起李斯特菌病的安全風(fēng)險應(yīng)引起關(guān)注。

利益沖突：無