渭南地區(qū)雞大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測

李娟娟，魏 恒

(渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 渭南 714026)

雞大腸桿菌病是由大腸埃希氏菌的致病性血清型引起雞的一種傳染病，常見致病血清型主要為O78:K80、O2:K1、O1:K1，其次是O55、O35等[1]。臨床上表現(xiàn)有急性敗血型、輸卵管炎、腸炎、氣囊炎、卵黃性腹膜炎等多種病型，其中以急性敗血型危害最大，其病變主要為心包炎、肝周炎和腹膜炎等。本病多發(fā)生于雛雞和青年雞，主要通過消化道、呼吸道傳播，全年均可發(fā)生，但以冬末春初較為多見。近年來，隨著養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，該病已成為困擾養(yǎng)雞場的重要疾病之一。由于該菌有許多血清型，雞只發(fā)病時(shí)常與其他疾病并發(fā)或繼發(fā)，又因在養(yǎng)雞生產(chǎn)中盲目濫用抗菌藥物，致使其耐藥菌株逐步增多，造成該病的臨床治療難度增加，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大損失。筆者研究主要從渭南地區(qū)養(yǎng)雞場中采集疑似雞大腸桿菌病病料樣品，對病料樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定、致病性試驗(yàn)和耐藥性試驗(yàn)，以掌握本地區(qū)雞大腸桿菌的耐藥現(xiàn)狀，為臨床防治該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 從渭南地區(qū)養(yǎng)雞場疑似雞大腸桿菌病病死雞中，無菌采集肝臟、脾臟和心臟病料樣品共計(jì)33份。

1.1.2 試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，細(xì)菌藥敏紙片等均購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 供試動(dòng)物 1日齡健康海蘭褐蛋雛公雞，購于蒲城縣龍池種雞場。試驗(yàn)期間隔離飼養(yǎng)，統(tǒng)一管理。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 將采集的病料樣品在無菌條件下，接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。然后挑取疑似菌落再接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，選取疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)。將符合大腸桿菌形態(tài)特征的疑似菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，冷藏備用。

1.2.2 生化試驗(yàn) 根據(jù)細(xì)菌微量生化反應(yīng)管產(chǎn)品使用說明，將純化后的待檢菌進(jìn)行麥芽糖、乳糖、甘露醇和葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)，靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 致病性試驗(yàn) 分別將生化試驗(yàn)鑒定后的菌株接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24 h。將3日齡雛雞隨機(jī)分組，每組10只，試驗(yàn)組每只雛雞腹腔注射0.2 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，對照組每只雛雞腹腔注射0.2 mL無菌營養(yǎng)肉湯。對照組和試驗(yàn)組分別隔離飼養(yǎng)7 d，期間觀察雛雞發(fā)病和死亡情況，并對死亡雛雞及時(shí)剖檢，采集肝臟、脾臟和心臟病料。7 d后對試驗(yàn)組仍存活的雛雞進(jìn)行剖檢，觀察剖檢病變，并采集病料。隨后對采集病料進(jìn)行分離純化和生化試驗(yàn)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法(K-B法)，選取15種常用抗菌藥物進(jìn)行雞大腸桿菌的耐藥性檢測。將致病性菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)24 h。然后取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)菌液適量，均勻涂抹于MH瓊脂培養(yǎng)基，約5 min待干后，分別將藥敏紙片均勻粘貼于MH瓊脂培養(yǎng)基上，并使其嚴(yán)密附著。37℃條件下將平板倒置培養(yǎng)16～18 h，觀察并判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

從渭南地區(qū)養(yǎng)雞場采集的病料中共分離出疑似大腸桿菌菌落27株，分離菌落在在麥康凱培養(yǎng)基上呈紅色，表面光滑、濕潤、邊緣波狀或整齊、微凸起；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上為紫黑色，圓形，帶金屬光澤。用革蘭氏染色為陰性菌，油鏡觀察為桿菌，兩端鈍圓，散在或成對排列。其菌落特征、革蘭氏染色和鏡檢結(jié)果與大腸桿菌相吻合。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

27株疑似大腸桿菌分離菌株均能利用甘露醇、乳糖、麥芽糖和葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)和尿素酶試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，MR試驗(yàn)和靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽性，試驗(yàn)結(jié)果符合大腸桿菌生化特性，說明分離菌為大腸桿菌。

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

27組試驗(yàn)組中有26組在接種大腸桿菌4 h后開始發(fā)病，雛雞出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、厭動(dòng)、翅下垂、下痢等癥狀，8 h后開始出現(xiàn)死亡，18～24 h為死亡高峰期；1個(gè)試驗(yàn)組和對照組雞只正常，無死亡。將26組試驗(yàn)組的病死雞和7 d后未死亡的雞進(jìn)行剖檢，均出現(xiàn)不同程度的心包炎、肝周炎、氣囊炎和腸炎，具體表現(xiàn)為心包積液，心包膜增厚、增厚，肝臟腫大，嚴(yán)重的附著有纖維性滲出物；腸管黏膜充血或出血。1組試驗(yàn)組和對照組雞只剖檢沒有病變。采集病料進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果與大腸桿菌特性相同。結(jié)果表明經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定的27株分離菌株中有26株為致病性大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，將分離鑒定的26株致病性大腸桿菌分別進(jìn)行15種常見抗菌藥物的耐藥性檢測，結(jié)果表明，對頭孢曲松和阿米卡星敏感的菌株較多，分別占分離菌株的76.9%和65.4%；對阿莫西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、鏈霉素、多粘菌素和恩諾沙星等藥物耐藥的菌株較多，均達(dá)53%以上，其中對阿莫西林、四環(huán)素和復(fù)方新諾明耐藥菌株最多，分別達(dá)84.6%、76.9%和73.1%。

表1 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，由于養(yǎng)雞場對抗菌藥物的不合理使用，造成雞大腸桿菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，其主要原因就是大腸桿菌的耐藥性隨著耐藥質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生[2]。筆者試驗(yàn)對分離鑒定的26株致病性大腸桿菌分別進(jìn)行15種常見抗菌藥物的耐藥性檢測，結(jié)果表明，分離菌株對頭孢曲松和阿米卡星較為敏感，對阿莫西林、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、鏈霉素、多粘菌素和恩諾沙星等藥物的耐藥性較強(qiáng)。對分離菌株進(jìn)行耐藥性分析得出，渭南地區(qū)雞大腸桿菌對多種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥作用，且具有多重耐藥性，耐藥菌譜廣的特點(diǎn)，這可能與本地區(qū)養(yǎng)雞場臨床上長期不規(guī)范使用或?yàn)E用抗菌藥物有關(guān)。

與其他地區(qū)雞大腸桿菌的耐藥性相比，張強(qiáng)等對安丘市部分雞場分離鑒定的16株致病性雞大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的雞源大腸桿菌對頭孢曲松敏感，對阿米卡星、頭孢噻肟、氨曲南和頭孢他啶較為敏感[3]。林大捷對海南文昌某種雞場疑似雞大腸桿菌病的病料進(jìn)行分離鑒定與藥敏試驗(yàn)研究，結(jié)果表明分離菌株對頭孢哌酮、多粘菌素B、頭孢拉定、慶大霉素、新霉素、阿米卡星等藥物敏感[4]。譚菊等對江蘇省大豐地區(qū)分離鑒定的186株雞大腸桿菌菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株對硫酸粘菌素、頭孢噻呋、頭孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星和新霉素高度敏感[5]。韋麗莉?qū)确坏貐^(qū)分離的205株大腸桿菌開展藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明分離株對頭孢喹肟鈉、安普霉素、大觀霉素、美羅沙星等抗菌藥物敏感[6]。魏清宇對山西省北部地區(qū)分離鑒定的134株大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明分離菌株對卡那霉素和頭孢喹肟較敏感[7]。由此說明，不同地區(qū)引起雞大腸桿菌病的致病菌耐藥性也有所不同，這與當(dāng)?shù)爻Ｓ每咕幬锏牟煌泻艽箨P(guān)系。

總之，由于大腸桿菌的血清型眾多，且沒有交叉保護(hù)性，易產(chǎn)生耐藥性，不同地區(qū)雞場該菌的耐藥性也有很大差別，臨床上還常與其他疾病并發(fā)或繼發(fā)，給本病的防控造成很大困難。因此，本病的防控應(yīng)注意做好環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)雞只飼養(yǎng)管理，消除疾病發(fā)生誘因，控制飼養(yǎng)密度，定期消毒，衛(wèi)生防疫措施要嚴(yán)格執(zhí)行；對發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)可制備針對本場的自家滅火苗；臨床治療時(shí)要先分離出病原菌，再進(jìn)行耐藥性檢測，以挑選敏感性藥物進(jìn)行治療。