茄子黃萎病病原菌致病型分化及其生物防治

劉晶晶，龐葉洲，張敬澤

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院生物技術(shù)研究所，杭州 310058）

茄（Solanum melongenaL.）是世界上最主要的蔬菜作物之一，我國是世界上最大的茄子生產(chǎn)國和消費國[1]。茄子在浙江省的種植面積達到26 667 hm2（根據(jù)浙江省農(nóng)業(yè)廳2018年統(tǒng)計數(shù)據(jù)），是受到消費者們歡迎的蔬菜產(chǎn)品之一。但近年來，茄子黃萎病在浙江一些地區(qū)發(fā)生嚴重，尤其在大棚溫室條件下，該病害的發(fā)生嚴重影響了茄子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

茄子黃萎病是由土傳病原輪枝菌（Verticilliumspp.）引起的。國內(nèi)的一些研究報道認為，茄子黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）引起的。然而，大麗輪枝菌寄主廣泛，依據(jù)致病性被劃分為落葉型和非落葉型2種致病株系[2]，而依據(jù)寄主的抗性遺傳，該病原菌又被劃分為1號生理小種和2號生理小種2類小種[3-4]。大麗輪枝菌的1號生理小種只在缺少抗病基因Ve1的寄主上具有致病性，而2號生理小種能夠克服抗病基因Ve1介導的抗病性。利用特異性引物，病原菌生理小種能被鑒定，為抗病品種的選擇和利用提供了重要信息。但迄今為止，在浙江危害茄子的病原菌致病型和生理小種類型尚未見報道。

大麗輪枝菌產(chǎn)生黑色多細胞微菌核，長期存活于土壤中，使茄子黃萎病成為最難防治的土傳病害之一。雖然利用抗病品種防治黃萎病是最經(jīng)濟和有效的手段，但生產(chǎn)上還缺乏免疫或高抗的優(yōu)良茄子品種。一些研究認為：作物輪作對此病害的防治是有效的，但由于農(nóng)業(yè)栽培面積的限制，這項技術(shù)還不能被廣泛應用[5]；多菌靈、三環(huán)唑苯來特和托布津類殺菌劑被認為可以有效防治輪枝菌引起的病害[6-7]，但迄今還沒有注冊用于防治該類病害的殺菌劑[8]。另外，病原菌一旦進入寄主木質(zhì)部，殺菌劑便失去了對病原菌的抑制作用。同時，殺菌劑的廣泛使用也使得人們對環(huán)境和健康問題開始擔憂。利用微生物進行生物防治的研究已經(jīng)取得了很大進展，大量的生防真菌和細菌已被發(fā)現(xiàn)和深入研究[9-12]，生物防治被認為是最有希望替代化學殺菌劑的方法之一。本實驗室也篩選出了5株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）株系[13]。其中，體外拮抗活性試驗結(jié)果表明，株系ShX301具有最好的抑制效果，該株系被用于棉花黃萎病生防研究，取得了良好的效果。然而，體外篩選拮抗最好的株系與植物體內(nèi)接種試驗的結(jié)果有時沒有直接的可比性，有研究顯示，一些在體外培養(yǎng)基上對病原菌無效的株系卻在植物體內(nèi)試驗中是有效的[14]。因此，還需要測定其余4個株系在植物體內(nèi)防治病害的試驗效果，從而進一步評價和比較ShX301的生物防治潛力。另外，一些報道認為，多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)[15-16]和脂肽類抗生素[17-19]，它們是拮抗病原菌的主要物質(zhì)；但這些揮發(fā)性物質(zhì)是否含有脂肽類化合物成分，在這5個株系中還沒有被分析。因此，本研究觀察了茄子黃萎病在浙江省紹興市上虞區(qū)大棚溫室內(nèi)的發(fā)生情況，鑒定了致病病原菌種類，測定了病原菌致病型和生理小種；利用獲得的多粘類芽孢桿菌進行了茄子黃萎病的防治研究，并通過測定多粘類芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌效果，以及利用

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS）全細胞原位檢測技術(shù)測定了多粘類芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽化合物，揭示了它們的主要拮抗機制。這為茄子黃萎病的生物防治提供了可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害觀察

為了明確茄子黃萎病害在大棚溫室內(nèi)的發(fā)生情況，于2017—2018年在浙江省紹興市上虞區(qū)崧廈鎮(zhèn)進行了病害定點觀察。選擇不同的茄子栽培品種，包括杭茄2010、秀峰紫長茄、杭茄一號、杭茄六號、紫光、紫軒、引茄等，進行病害觀察和癥狀描述。同時，采集具有典型癥狀的樣品，用于室內(nèi)茄子黃萎病病原菌的分離。

1.2 病原菌分離鑒定和致病性試驗

用采集的樣品進行茄子黃萎病病原菌的分離。采用水瓊脂培養(yǎng)基（water agar media,WA）對病株進行組織分離和培養(yǎng)，依據(jù)形態(tài)學和微菌核特征進行病原菌鑒定。選擇代表性的株系進行單孢分離純化。將獲得的單孢子株系分裝在含有20%甘油的離心管（1.5 mL）中，在－70℃條件下保存。

為了用分離的菌株進行致病性試驗，選用杭茄2010作為測試品種。將茄子種子催芽后，播種到含有營養(yǎng)基質(zhì)的塑料盆中，放置在28℃光照16 h和22℃黑暗8 h交替的培養(yǎng)箱中，4葉期后用于接種。用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth,PDB）制備分生孢子懸浮液，采用切根接種法接種，觀察不同分離株系的病害發(fā)生情況。

1.3 病原菌致病型的測定

為了明確分離所得的茄子黃萎病病原菌的致病型，用特異性引物對INTD2f/INTD2r和INTNDf/INTNDr對病原菌的基因組DNA進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增[20]。以非落葉型菌株BP2、TX9及落葉型菌株VD084、VD991為參照株系。病原菌基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB）法[20]。所用引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 病原菌生理小種的測定

為了鑒定病原菌生理小種類型，采用大麗輪枝菌1號生理小種的特異性引物對vdr1/vdr2[3]和2號生理小種特異性引物對vdR2F/vdR2R[4]對病原菌基因組DNA進行PCR擴增?；蚪MDNA提取方法和引物合成同1.3。

1.5 多粘類芽孢桿菌對病原菌拮抗活性的室內(nèi)測定

采用對峙培養(yǎng)方法[10,13]，室內(nèi)測定本實驗室篩選的5株多粘類芽孢桿菌菌株（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）對分離于茄子上的病原菌菌絲的抑制效果。多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液的制備：將菌株接種在改良的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（酵母粉1 g，牛肉膏3 g，蛋白胨 5 g，蔗糖10 g，pH 7.2）中，在 200 r/min、30℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h。首先將含有病原菌的菌餅接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基平板中心，然后在距離平板中心2.5 cm的十字交叉線上放置4個含有多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液細胞的濾紙片（直徑8 mm）。將平板放置在27℃黑暗條件下培養(yǎng)。以不含細菌細胞的濾紙片作為對照。每個處理重復3次。

為了室內(nèi)測定多粘類芽孢桿菌對病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果，將制備的大麗輪枝菌孢子懸浮液（1×106CUF/mL）200 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，在無菌通風櫥中除去多余水分后，接種含有多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液細胞的濾紙片于平板中央。將平板放置在27℃黑暗培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d后，測量抑菌圈直徑；以接種無細菌細胞的濾紙片作為對照。每個處理重復3次。

為了明確多粘類芽孢桿菌株系是否產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，以及揮發(fā)性物質(zhì)對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用[16]，采用間隔培養(yǎng)皿進行測定。制備含有PDA的間隔培養(yǎng)皿平板，將含有大麗輪枝菌菌絲的菌餅（直徑5 mm）接種在一室中心，另一室涂布100 μL多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液（1×108CUF/mL），將培養(yǎng)皿放置在26℃黑暗條件下培養(yǎng)。于接種3、5和7 d后，測量菌落直徑。以涂布滅菌水的處理作為對照。試驗重復3次。

1.6 茄子黃萎病防治試驗

選用茄子品種杭茄2010作為接種植物，用分離于茄子上的大麗輪枝菌SY1-1株系制備微菌核。首先，從20個培養(yǎng)皿上刮取在PDA上培養(yǎng)40 d左右的微菌核，然后與土壤基質(zhì)[V（田間土壤）∶V（蛭石）∶V（營養(yǎng)土）=1∶1∶1]混合均勻，分裝在塑料小盆中，使基質(zhì)中微菌核的數(shù)量達115個/g[21]。將種子催芽后播種于含有微菌核土壤基質(zhì)的塑料小盆中，并將塑料小盆置于可容納20個小盆的塑料盤中。以播種不含有病原菌種子的土壤基質(zhì)小盆作為對照。然后，每個小盆接種10 mL（1×108CFU/mL）生防菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）的發(fā)酵液。以僅接種生防菌發(fā)酵液或不含生防菌的培養(yǎng)液的處理作為對照。每個處理為1盤（20個植株），且每個處理重復3次。將塑料盤置于28℃光照16 h和20℃黑暗8 h交替的培養(yǎng)室中，觀察黃萎病的發(fā)病和發(fā)展情況。50 d后統(tǒng)計發(fā)病率和病害嚴重度（disease severity,DS）比率。茄子黃萎病分級標準按照《農(nóng)藥田間藥效試驗準則第34部分：殺菌劑防治茄子黃萎病》（NY/T 1464.34—2010）（0級：無病害癥狀；1級：病葉數(shù)小于10%；3級：病葉數(shù)在11%～25%之間；5級：病葉數(shù)在26%～50%之間；7級：病葉數(shù)大于50%，且未死亡；9級：植株死亡），統(tǒng)計病害嚴重度比率[22]。

1.7 促進植物生長試驗

已有研究證實，5株多粘類芽孢桿菌株系（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）對棉花有促進生長作用[13]。為了評價這些株系是否對茄子植物也有促進生長作用，進行如下試驗。將杭茄2010種子催芽后，播種于含有上述土壤基質(zhì)（見1.6節(jié)）的塑料小盆中，每個小盆接種10 mL（1×108CFU/mL）生防菌發(fā)酵液。用無菌培養(yǎng)液作為對照。植物生長條件如上所述（見1.6節(jié)）。每個處理包含20個植株（1盤），且每個處理重復3次。50 d后，測量待測茄苗莖和根的長度、植物地上部和地下部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，分析不同生防株系對植物生長的促進作用。

1.8MALDI-TOF-MS檢測

用MALDI-TOF-MS檢測和分析生防株系（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）的脂肽化合物。在30℃條件下，待生防菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落溶解于含有基質(zhì)溶液的離心管（2.0 mL）中。基質(zhì)液含有10 mg/mL氰基-4-羥基肉桂酸、30%乙腈和0.1%三氟乙酸（TFA）。溶液被混勻后，在5 000 r/min下離心2 min，然后吸取1 μL溶液樣品滴加在MALDI-TOF MTP 384靶盤（Bruker公司，德國）上，用配置智能光束激光器的ultrafleXtremeTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀（Bruker公司，德國）記錄數(shù)據(jù)。測量是在反射操作模式和離子源加速電壓20 kV條件下進行的。質(zhì)譜分布在0.1～2.0 kDa間的低質(zhì)量范圍區(qū)。依據(jù)文獻報道和測定的脂肽系列質(zhì)譜峰，分析不同株系間產(chǎn)生的脂肽化合物及其對大麗輪枝菌可能的拮抗機制。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害觀察的結(jié)果

對茄子黃萎病定點觀察表明，在溫室大棚中，零星的病株都出現(xiàn)于2017和2018年1月中旬（每年11月下旬移栽于大棚中）。依據(jù)這2年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：病害發(fā)生1周后，大棚溫室中不同栽培品種的病害發(fā)病率在0.08%～1.1%之間；3周后，不同品種間發(fā)病率在4%～8%之間；隨后，隨著氣溫的上升，發(fā)病率趨于穩(wěn)定，沒有顯著增加（直至6月中旬采收結(jié)束）。

如圖1所示：茄子黃萎病癥狀首先出現(xiàn)在下部葉片邊緣，呈V字形的褪綠黃斑（圖1A），隨后病斑擴大，明顯不受葉脈限制（圖1B）。有時，侵染的病害僅發(fā)生在葉片的一邊，而另外一邊葉片繼續(xù)生長，形成半葉癥狀（圖1C）。隨著病害的發(fā)展，病葉下垂，早期被侵染的葉片也開始出現(xiàn)壞死（圖1D）。由于病害向上擴展，同一病株上部侵染的病葉邊緣經(jīng)常向內(nèi)卷曲，而下部嚴重侵染的葉片向下披垂（圖1E）。早期侵染的植株出現(xiàn)矮化，整個植株呈現(xiàn)枯萎狀，但病葉很少脫落（圖1F），最終整個植株死亡。

2.2 病原菌分離鑒定和致病性試驗結(jié)果

用WA培養(yǎng)基進行病原菌的組織分離培養(yǎng)，依據(jù)菌落特征、輪枝形態(tài)和微菌核產(chǎn)生情況，選擇和確定病原菌的菌落。隨后，轉(zhuǎn)移它們到PDA培養(yǎng)基上，進一步進行鑒定。結(jié)果表明，在典型癥狀的病株上都能分離到大麗輪枝菌。選擇來源于不同地點和不同品種上的菌落進行單孢分離，獲得7個單孢株系[SY1-1（杭茄2010）、SY1-2（秀峰紫長茄）、SY1-3（紫光）、SY2-1（紫軒）、SY2-2（引茄）、SY3-1（杭茄一號）、SY3-2（杭茄六號）]。用這些單孢株系進行植株接種試驗，結(jié)果顯示：接種2周后，葉片表現(xiàn)黃萎病癥狀；接種3周后，所有植株都能顯示黃萎病典型癥狀。證實它們都是致病菌。

2.3 病原菌致病型鑒定結(jié)果

圖1 茄子黃萎病癥狀Fig.1 Symptoms of Verticillium wilt of eggplant

用大麗輪枝菌落葉型特異性引物對擴增7個分離于茄病植株上的分離株系（SY1-1、SY1-2、SY1-3、SY2-1、SY2-2、SY3-1、SY3-2），電泳結(jié)果（圖2）顯示：分離于茄子上的7個株系和落葉型菌株（VD084和VD991）顯示一個長度為460 bp的電泳條帶。相似地，用大麗輪枝菌非落葉型特異性引物對擴增上述株系，僅2個非落葉型菌株（BP2和TX9）產(chǎn)生長度為1 160 bp的電泳條帶。這些結(jié)果表明，7個從茄子病株上分離的菌株均屬于落葉型株系。

2.4 病原菌生理小種的鑒定結(jié)果

用黃萎病菌生理小種1號和生理小種2號特異性引物對擴增分離于茄子病株上的7個菌株（SY1-1、SY1-2、SY1-3、SY2-1、SY2-2、SY3-1、SY3-2），電泳結(jié)果顯示，用生理小種1號特異性引物對擴增的PCR產(chǎn)物沒有電泳條帶（圖3A），而用生理小種2號特異性引物對擴增出一個長度約250 bp的電泳條帶（圖3B）。這些結(jié)果表明，7個從茄子病株上分離的株系均屬于2號生理小種。

2.5 對病原菌菌絲及孢子萌發(fā)的抑制效果

5株多粘類芽孢桿菌對茄子大麗輪枝菌的菌絲抑制作用試驗的結(jié)果（表1）顯示：多粘類芽孢桿菌株系對茄子大麗輪枝菌的菌絲都有顯著的抑制作用，且株系ShX301在接種10 d后顯示出最好的抑制效果（85.23%）（P＜0.05），其次是株系Hb6。對病原菌孢子萌發(fā)抑制效果顯示，5株多粘類芽孢桿菌對茄子大麗輪枝菌的分生孢子萌發(fā)都有顯著的抑制作用，其中株系ShX301的抑制效果最顯著（P＜0.05），平均抑制直徑超過33 mm。這些結(jié)果與前期的研究報道[13]相似。

2.6 揮發(fā)性物質(zhì)對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用

圖2 落葉型和非落葉型特異性引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agrose geleletrophoresis ofPCR products of defoliating and nondefoliating pathotype isolates obtained with specific primers

用間隔培養(yǎng)皿測定5株多粘類芽孢桿菌（ShX301、ShX302、ShX303、Hb1、Hb6）對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用。結(jié)果顯示，5株多粘類芽孢桿菌都產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，它們對大麗輪枝菌菌絲生長都有顯著的抑制作用（P＜0.05）（圖4）。其中，株系Hb6在接種后3、5和7 d顯示最好的抑制效果，且在接種后3和7 d與其他4個株系間存在顯著差異。

圖3 生理小種1號和生理小種2號特異性引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agrose gel eletrophoresis of PCR products amplified with race-1 and race-2 specific primers

2.7 對茄子黃萎病的防治效果

圖4 5株多粘類芽孢桿菌揮發(fā)性物質(zhì)對大麗輪枝菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of volatile metabolites produced by five strains of P.polymyxa on hyphal growth of V.dahliae

接種試驗結(jié)果表明，5株多粘類芽孢桿菌株系在一定程度上能夠延遲茄子黃萎病的發(fā)病時間，降低病害發(fā)病率和嚴重度比率。接種30 d后，僅接種微菌核的處理開始出現(xiàn)癥狀，35 d后，接種“微菌核+ShX302”和“微菌核+ShX303”的處理開始出現(xiàn)癥狀，隨后，接種“微菌核+Hb1”和“微菌核+Hb6”的處理依次開始出現(xiàn)癥狀。而接種“微菌核+ShX301”的處理直到39 d后才開始出現(xiàn)癥狀。統(tǒng)計接種50 d后發(fā)病率和病害嚴重度比率的結(jié)果（表2）表明，多粘類芽孢桿菌株系ShX301、Hb6、Hb1、ShX302和ShX303分別使病害發(fā)病率降低30%、25%、23.33%、15%和13.3%，使病害嚴重度比率減少20.02%、17%、16%、8.76%和6.94%。然而，雖然菌株ShX301對茄子黃萎病具有最好的防治效果，但與株系Hb6的發(fā)病率間無顯著差異（P＞0.05），而與其他3個株系在發(fā)病率間存在顯著差異。

2.8 對植物生長促進試驗結(jié)果

為了評價多粘類芽孢桿菌對茄子生長的促進作用，將5株多粘類芽孢桿菌株系（ShX301、Hb6、Hb1、ShX302和ShX303）用于接種試驗。結(jié)果（圖5）顯示，接種50 d后，與對照相比，所有株系都顯著促進了植株的生長和生物量的增加。菌株ShX301與其他菌株相比較，顯著促進了植株莖的伸長（P＜0.05），增長率為59.24%，也促進了植株地上和地下部生物量的增加，其中：地上部鮮質(zhì)量為（10.25±0.96）g、干質(zhì)量為（1.15±0.19）g，地下部鮮質(zhì)量為（1.06±0.14）g、干質(zhì)量為（0.21±0.05）g（表3）。其次，菌株Hb6對茄子生長的促進作用也較顯著。

表2 接種50 d后5株多粘類芽孢桿菌對茄子黃萎病的防治效果Table 2 Inhibitory efficacy of five P.polymyxa strains against Verticillium wilt of eggplant 50 d after inoculation

圖5 接種50 d后5株多粘類芽孢桿菌對茄苗生長的促進效果Fig.5 Effects of five P.polymyxa strains on the growth promotion of eggplant seedlings 50 d after inoculation

表3 5株多粘類芽孢桿菌對茄子生長促進作用的測定結(jié)果Table 3 Determination results for five P.polymyxa strains promoting eggplant plant growth

2.9MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果

5株多粘類芽孢桿菌株系（ShX301、Hb6、Hb1、ShX302和ShX303）的MALDI-TOF-MS分析結(jié)果揭示，所有株系共有1個顯著主峰區(qū)，質(zhì)荷比（m/z）范圍在860～1 050之間（圖6），由系列峰構(gòu)成，它們被歸屬于已知的殺鐮孢菌素（fusaricidins）[23]。然而，株系Hb1還具有另外2個明顯的峰區(qū)，其質(zhì)荷比（m/z）范圍在1 140～1 200和1 580～1 680之間（圖6A），分別由系列峰構(gòu)成，分別歸屬為多黏菌素（polymyxins）和十三肽素（tridecaptins）[23-27]。雖然株系Hb1擁有多黏菌素和十三肽素，但與其他株系相比較，并沒有增加其對大麗輪枝菌的抑制活性，這也與其他研究報道[17-19]一致。多黏菌素具有一個窄的抗菌譜，主要對革蘭氏陰性細菌具有抗菌活性[25-26]，十三肽素也主要抑制革蘭氏陰性細菌的活性[27]。顯然，多粘類芽孢桿菌對大麗輪枝菌的抑制活性物質(zhì)是殺鐮孢菌素。

圖6 多粘類芽孢桿菌非核糖體脂肽的MALDI-TOF-MS分析圖Fig.6 MALDI-TOF-MS analysis of nonribosomal lipopeptides produced by P.polymyxa strains

殺鐮孢菌素是由一類拮抗真菌的環(huán)脂肽化合物構(gòu)成的[28]，可抑制革蘭氏陽性細菌和許多真菌[29-30]。MALDI-TOF-MS分析結(jié)果（表4）顯示，5株多粘類芽孢桿菌株系都產(chǎn)生系列殺鐮孢菌素A（m/z為883,[M+H]+）、B（m/z為897,[M+H]+）、C（m/z為947,[M+H]+）、D（m/z為961,[M+H]+）和LI-F類抗生素[23]，但系列峰的強度明顯不同。

3 討論

茄子黃萎病發(fā)生在我國許多地區(qū)，但由于茄子栽培方式、環(huán)境條件和使用品種的不同，病害危害程度和表現(xiàn)的癥狀有所變化。對大棚溫室內(nèi)茄子黃萎病發(fā)生和發(fā)展觀察結(jié)果表明，病害在1月中旬左右開始發(fā)生，持續(xù)發(fā)展到2月底或3月初。這時期大棚溫室氣溫在22～28℃之間，適合于病原菌生長發(fā)育，也有利于病害的發(fā)生和發(fā)展。而到3月中旬后，氣溫開始迅速回升，白天氣溫通常超過30℃，此時氣溫已不利于病原菌生長，同樣抑制了病害的發(fā)展。這一觀察結(jié)果與已有報道[20]相一致，也為病害防治提供了依據(jù)。同時，我們系統(tǒng)描述了茄子黃萎病發(fā)生和發(fā)展的癥狀變化，為田間病害識別和診斷提供了參考。另外，對病原菌的致病型和生理小種鑒定表明，所有分離系均屬于落葉型株系和2號生理小種，為合理利用和選育抗病品種提供了理論依據(jù)。

一些研究顯示，生防菌體外活性測定與植物體內(nèi)試驗不完全一致。體外測定的無活性株系，在植物體內(nèi)試驗顯示具有很高的活性[14]。本實驗室成員前期研究表明，室內(nèi)篩選出的株系ShX301對大麗輪枝菌顯示最高活性[13]，隨后，用ShX301進行防治棉花黃萎病和促進植物生長的體內(nèi)試驗，顯示其具有生防菌和促生菌的潛力。然而，由于對其他4個株系（Hb6、Hb1、ShX302和ShX303）未進行植物體內(nèi)試驗，不能說明ShX301在植物體內(nèi)條件下也是活性最好的株系。因此，本文用這5個株系對分離于茄子上的大麗輪枝菌進行了體外和體內(nèi)系統(tǒng)試驗，以評價它們的生物防治和促生長潛力。研究結(jié)果表明，ShX301仍然是它們中最好的生物防治和促生長株系。該株系已保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC 11638），為其利用和開發(fā)應用奠定了基礎(chǔ)。

表4MALDI-TOF-MS對多粘類芽孢桿菌培養(yǎng)液的測定結(jié)果Table 4 Determination results for culture filtrates of P.polymyxa strains by MALDI-TOF-MS

雖然已有的研究揭示了5株多粘類芽孢桿菌的生防潛力，但其對大麗輪枝菌的作用機制還不清楚。因此，本文通過測定多粘類芽孢桿菌株系揮發(fā)性物質(zhì)和脂肽化合物成分來揭示其可能的作用機制。一些研究顯示，多粘類芽孢桿菌（P.polymyxaSb3-1）能通過釋放出揮發(fā)性物質(zhì)來抑制病原菌長孢輪枝菌（V.longisporum）的生長[15]，一些化合物已經(jīng)被鑒定[16]。我們的研究結(jié)果也證實，5個株系都能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，它們能顯著抑制病原菌生長，但不同株系間沒有顯著差異。多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生2類肽類抗生素：一類是多黏菌素（polymyxins）、多肽菌素（polypeptins）、十三肽素（tridecaptins）、gavaserin、saltavalin和喬利肽菌素（jolipeptin），它們主要拮抗細菌；而另一類是系列LI-F抗生素、谷纈菌素（gatavalin）和殺鐮孢菌素（fusaricidins），它們主要拮抗革蘭氏陽性細菌和真菌[17-19]。MALDI-TOF-MS檢測結(jié)果也證實，殺鐮孢菌素是多粘類芽孢桿菌拮抗大麗輪枝菌的主要拮抗物質(zhì)，而多黏菌素和十三肽素對大麗輪枝菌沒有拮抗活性。殺鐮孢菌素是一類肽抗生素，是具有5-胍基-3-羥基十五烷酸基結(jié)合到一個自由氨基上的一類環(huán)縮酚酸肽。目前，在多粘類芽孢桿菌中已報道12個殺鐮孢菌素，主要包括LI-F03a（殺鐮孢菌素C）、LI-F03b（殺鐮孢菌素D）、LI-F04a（殺鐮孢菌素A）、LI-F04b（殺鐮孢菌素B），以及a和b類似物LI-F05到LI-F08[23]。一些研究報道表明，不同的殺鐮孢菌素類型對不同病原菌真菌的抗菌活性是不同的，如殺鐮孢菌素A、B、C和D對尖孢鐮刀菌和番茄灰葡萄孢（Botrytis cinerea）具有顯著的拮抗活性[31-32]，而LI-F類抗生素LI-F03、LI-F04、LI-F05、LI-F07和LI-F08對一些細菌和真菌具有不同的抗菌活性水平[29]。MALDITOF-MS分析結(jié)果顯示，5個多粘類芽孢桿菌株系都產(chǎn)生系列殺鐮孢菌素A、B、C和D及LI-F類抗生素，但他們對病原菌的拮抗活性明顯不同，可能涉及有效化合物成分及其含量。雖然系列峰的強度在株系間存在差異，但因MALDI-TOF-MS不具有定量分析的功能，峰的強度與化合物含量間沒有相關(guān)性。因此，本研究也為進一步鑒定殺鐮孢菌素對大麗輪枝菌作用的主要成分及揭示其拮抗機制提供了重要信息。