尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸聯(lián)合目標體溫管理對重型顱腦創(chuàng)傷大鼠的神經保護作用▲

時 華 涂 悅 王振國 吳煥成 劉 洋

(武警特色醫(yī)學中心1 神經外一科，2 腦科中心，天津市 300162，電子郵箱：liq_doc@163.com；3 天津醫(yī)科大學研究生院，天津市 300070；4 上海市第四人民醫(yī)院神經內科，上海市 200081)

近年來，隨著交通運輸及經濟的發(fā)展，顱腦創(chuàng)傷的發(fā)生率逐年升高，尤其是重型顱腦損傷(severe traumatic brain injury,STBI)患者，死亡率和致殘率居高不下，總死亡率可達30%～50%[1-2]。雖然國內針對顱腦損傷的基礎及臨床研究不斷深化，治療效果顯著提高，但仍有諸多問題亟待解決，特別是STBI后腦水腫、線粒體的功能障礙，遲發(fā)性神經元損傷等繼發(fā)性損傷的防治[3]。病理過程的復雜也導致目前尚無針對顱腦損傷治療的藥物。盡管制藥公司投資了數(shù)十億美元用于STBI相關藥物的研發(fā)，但至今仍沒有明確有效的藥物可用于顱腦損傷急性期的治療[4]。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)是一種普遍存在的嘧啶核苷酸，近期有研究顯示，其可通過調節(jié)蛋白之間的相互作用，激活沉默信息調節(jié)因子通路，并改善線粒體功能，從而延長酵母、果蠅和小鼠的壽命[5-6]。NAD是否可以改善顱腦損傷后的神經損傷癥狀，發(fā)揮腦保護作用，值得探討。目前，目標體溫管理(targeted temperature management，TTM)仍用于STBI的治療，且合理應用時其療效十分可觀[7]。有研究表明，STBI患者進行TTM的預后良好率為68.9%，而溫度控制不佳的STBI患者預后良好率僅為46.7%[8]。因此，本實驗擬基于線粒體生物合成機制，探索NAD聯(lián)合TTM治療對STBI神經功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠60只購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[許可證號：SYXK-(軍)2007-04]，7～8周齡，體質量220～250 g，4只/籠，每日光照12 h，自由飲食。

1.2 儀器與試劑 3001L電子腦皮質撞擊儀(美國Thermo Fisher公司)，W18Cr4V型高速磨鉆(韓國SUESHIN公司)，WSS-100型電干燥/恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特儀器有限公司)，SCSP-502型酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，ZLJ-2000Ⅱ亞低溫治療儀(長春安泰有限責任公司)。NAD、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、丙二醛檢測試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司(批號：A114-1-1、H052、A003-4-1)，兔抗小鼠受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)、中樞神經特異性蛋白S100β、 水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)、緊密橋接蛋白(tight junction protein,TJP)單克隆抗體均購自美國 Cell Signaling Technology 公司(批號：ab50031、ab10277、ab34119、ab213651)，煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)購自上海署燦實業(yè)公司(批號：37120-17-1)。

1.3 STBI模型的制備 將60只大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組48只、對照組12只。模型組構建STBI模型[9]：給予大鼠腹腔注射青霉素10萬單位，隨后給予 5%水合氯醛(7 mL/kg)腹腔注射麻醉，鉆孔開顱骨窗后將大鼠固定于打擊平臺上；調整電子腦皮質撞擊儀的打擊臂使其與垂直方向呈20°的夾角，使用3 mm打擊帽，使打擊面與腦皮質表面基本平行并精確打擊大鼠大腦皮層；按最低點持續(xù)時間均為200 ms，4 mm的打擊深度，5 m/s的打擊速度構建重度STBI大鼠模型。打擊完成后用浸濕生理鹽水的棉球止血，隨后縫合皮膚。對照組則不進行任何操作。術后若出現(xiàn)死亡則增補相應數(shù)量的大鼠。

1.4 干預方法 在完成造模后，將48只STBI大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組，即STBI組、STBI+TTM組(S+T組)、STBI+NAD組(S+N組)、STBI+TTM+NAD組(S+T+N組)，每組12只。將NAD的前體NMN溶于生理鹽水中，配制成5%濃度的溶液。S+T組和S+T+N組在STBI后行TTM治療，具體方法如下：連接亞低溫治療儀后，設定冰毯溫度為7℃，時程設定為6 h，在STBI后10 min，將大鼠置于冰毯上，約20 min后肛溫達到33℃～34℃時，每間隔30 min測1次溫度以保持體溫維持在亞低溫水平。S+N組和S+T+N組大鼠按照500 mg/kg的劑量，于造模后第2天起每日8時和18時腹腔注射NMN，STBI組及S+T組大鼠于同一時間注射同等劑量的生理鹽水，均連續(xù)7 d。治療結束后，將大鼠放入室溫環(huán)境以緩慢復溫。對照組大鼠不進行任何處理。

1.5 行為學評分 于最后一次腹腔注射操作后12 h，按照Chen等[10]的方法對大鼠進行改良神經功能損傷量表(Modified Neurological Severity Scale,mNSS)評分，神經功能損傷癥狀越嚴重則分數(shù)越高。正常為0分，損傷最嚴重時為18分。

1.6 腦水腫程度評定 待上述實驗完成后，頸椎離斷法處死大鼠，每組隨機選取3只大鼠，取出腦組織并去除延髓及以下部分，立即稱重，記錄所得質量(濕重)。隨后將腦組織放入烘干箱中，70℃烘烤48 h，再次稱重并記錄所得質量(干重)，腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定 每組再隨機選取3只大鼠，切取損傷側同一部位組織標本，分別稱取重量50 mg，滴加入1 mL的磷酸緩沖鹽溶液，用超聲破碎儀將標本勻漿，以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清，酶聯(lián)免疫吸附法檢測NAD、丙二醛、TNF-α水平，按照試劑盒說明進行操作。

1.8 免疫印跡試驗 取各組剩余大鼠的腦組織，用4℃的無菌生理鹽水輕輕洗去腦組織表面的血液，取大鼠損傷部位周邊腦組織50 mg(對照組取同一側腦組織)并置于1.5 mL離心管中，充分破碎腦組織。提取蛋白后采用免疫印跡試驗法檢測S100β蛋白、AQP4、TJP水平，按照試劑盒說明進行操作。

1.9 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 5組大鼠神經功能損傷評分比較 與對照組比較，其余各組大鼠的mNSS評分均升高(均P<0.05)；S+T組、S+N組、S+T+N組的mNSS評分均低于STBI組，且S+T+N組的評分均低于S+T組、S+N組(均P<0.05)。見表1。

2.2 5組大鼠腦水腫程度比較 STBI組和S+N組大鼠的腦組織含水量均高于對照組；而S+T+N組腦組織含水量低于STBI組(P<0.05)，且與對照組差異無統(tǒng)計學意義，但S+T組、S+N組與STBI組比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠mNSS評分及腦組織含水量比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與STBI組比較，#P<0.05；與S+T+N組比較，▲P<0.05。

2.3 5組大鼠腦組織各因子水平比較 S+N組、S+T+N組NAD水平均高于對照組及STBI組，且S+T+N組NAD水平高于S+T組(均P<0.05)。STBI組、S+T組、S+N組的丙二醛、TNF-α水平均高于對照組；S+T+N組丙二醛、TNF-α水平均低于STBI組，且TNF-α水平低于S+T組和S+N組(均P<0.05)，但S+T組和S+N組的丙二醛、TNF-α水平與STBI比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 5組大鼠腦組織各因子水平比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05；與STBI組比較，#P<0.05；與S+T+N組比較，▲P<0.05。

2.4 5組大鼠腦組織S100β蛋白、AQP4和TJP表達水平比較 與對照組比較，其余4組大鼠腦組織的S100β蛋白、AQP4和TJP表達水平升高；而與STBI組比較，S+N組和S+T組大鼠腦組織的S100β和AQP4蛋白表達水平降低，S+T+N組S100β、AQP4和TJP表達水平均降低(均P<0.05)；S+T+N組S100β和TJP表達水平均低于S+N組和S+T組(均P<0.05)。見圖1及表3。

圖1 5組大鼠S100β蛋白、AQP4和TJP表達情況

組別nS100βAQP4TJPSTBI組61.70±0.07?0.83±0.10?1.13±0.07?S+T組61.52±0.07?#▲0.59±0.06?#1.06±0.09?▲S+N組61.23±0.10?#▲0.64±0.04?#1.05±0.10?▲S+T+N組61.01±0.10?#0.57±0.02?#0.88±0.04?#對照組60.65±0.050.49±0.020.56±0.04 F值81.99815.40130.213P值<0.001<0.001<0.001

注： 與對照組比較，*P<0.05；與STBI組比較，#P<0.05；與S+T+N組比較，▲P<0.05。

3 討 論

腦水腫是顱腦損傷后常見并發(fā)癥，常于發(fā)病后第2天達到高峰，這主要是由于創(chuàng)傷引起的腦組織缺血、缺氧以及Na+-K+離子泵的功能障礙可導致細胞水腫，其可造成顱內壓急劇增高，從而進一步使腦的血液灌注減少，加重病情，甚至導致腦疝威脅患者生命[11]。沈彤等[9]發(fā)現(xiàn)，大鼠的顱腦損傷程度越嚴重，腦含水量越高；黃紅潔等[12]也發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷可加重腦水腫的形成。本實驗結果顯示，與對照組比較，STBI組大鼠腦含水量升高，且mNSS評分下降(P<0.05)，這提示STBI后可出現(xiàn)持續(xù)的腦水腫，而這或可加重神經功能的損傷。究其原因，一方面，STBI后大鼠腦組織內丙二醛、TNF-α表達水平升高(P<0.05)，表明STBI加重了腦組織的炎癥及氧化應激水平，從而進一步加重了神經功能的損傷。黃樹宣等[13]也發(fā)現(xiàn)STBI小鼠雙側丘腦的炎癥細胞增加，且李峰等[14]也發(fā)現(xiàn)STBI患者急性期氧化應激平衡改變和炎癥反應標志物過表達，這些均不利于神經功能恢復；同時，較高的炎癥及氧化應激水平還可造成線粒體損傷，減少腦組織的氧供，加重腦水腫及神經功能損傷。另一方面，STBI大鼠腦組織水通道相關蛋白S100β、AQP4和TJP的表達水平升高(P<0.05)，這增加了血腦屏障通透性，也進一步促進了腦水腫的發(fā)生。

NAD是一種普遍存在的嘧啶核苷酸，可減弱新生大鼠皮質神經元DNA的氧化損傷[5]，外源性補充NAD可有效地保護氧化應激造成的神經元的凋亡[15]。由于直接攝入NAD會導致NAD在肝臟內被滅活，無法達到補充NAD的目的[16-17]，故本實驗采用NAD的前體NMN來補充體內NAD水平。TTM是指將患者核心體溫降低至特定溫度以修復或減輕由血液灌注不足導致的組織損傷。研究表明，體溫每下降1℃，腦組織代謝率降低6%～7%，氧代謝率下降6%～9%[18]，適度降低體溫可有效延緩大腦能量儲備耗竭。

本實驗結果顯示，S+T組、S+N組、S+T+N組大鼠的mNSS評分均低于STBI組，且S+T+N組的評分均低于S+T組、S+N組(均P<0.05)，提示單純應用NAD或TTM，以及兩者聯(lián)合應用均可改善STBI大鼠的神經損傷癥狀，而聯(lián)合應用的效果更佳。同時，S+T+N組腦組織含水量低于STBI組(P<0.05)，且與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但S+T組、S+N組與STBI組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。此外，S+T+N組丙二醛、TNF-α、S100β蛋白、AQP4和TJP表達水平均低于STBI組，且TNF-α、S100β蛋白和TJP表達水平低于S+T組和S+N組(均P<0.05)，提示將NAD與TTM合用，還可降低TNF-α水平，并更好地抑制血腦屏障通透性相關蛋白S100β和TJP的表達，改善血腦屏障通透性從而更好地抑制腦水腫的形成。這一定程度上可以降低機體氧化應激水平，減少興奮性神經遞質的產生以及鈣內流等多種不良效應，緩解線粒體功能障礙以及細胞膜的破裂，同時抑制炎癥因子、中性粒細胞的滲入及功能，減輕炎癥反應[18]。

綜上所述，STBI后，NAD和TTM聯(lián)用可有效發(fā)揮協(xié)同作用，進一步降低炎癥及氧化應激水平，減少血腦屏障通透性，減輕腦水腫，從而發(fā)揮神經保護作用，這或可為日后臨床治療STBI提供了新策略。