睪丸顯微取精術(shù)聯(lián)合卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射治療非梗阻性無精子癥的臨床效果

甘賢優(yōu) 零瀟賓 舒金輝 周 紅 楊 嫚

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院生殖中心，南寧市 530003，電子郵箱：2671302431@qq.com)

無精子癥約占男性不育因素的10%～20%[1]，臨床分為梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)，其中約有60%的患者為NOA[2]。自1998年Schlegel成功施行睪丸顯微取精術(shù)(microdissection testicular sperm extraction，MD-TESE)以來，該術(shù)式逐漸成為治療NOA的有效方法[3-4]。而MD-TESE聯(lián)合卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)可有效提高NOA患者生育后代的機(jī)會(huì)[5]。我中心近年來為30例NOA患者施行MD-TESE術(shù)，并對(duì)部分獲得精子的患者實(shí)施ICSI助孕治療，取得較好的臨床療效，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年10月至2018年4月在我中心施行MD-TESE術(shù)的NOA患者30例，年齡23～44(33.3±4.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合NOA的診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照《人類精液檢查與精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》[1]規(guī)定，不少于3次精液常規(guī)檢查提示離心沉淀后鏡檢未找到精子；同時(shí)遵照歐洲泌尿外科協(xié)會(huì)男性不育癥指南(2015年版)[6]的要求，NOA的診斷基于標(biāo)準(zhǔn)的臨床檢查程序，包括病史、體格檢查、精液常規(guī)分析、精漿生化檢查、血清生殖激素分析、超聲評(píng)價(jià)、染色體核型分析和無精子因子(azoospermia factor,AZF)檢測(cè)等；(2)近期無泌尿系感染或生殖系統(tǒng)感染；(3)無相關(guān)手術(shù)禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)梗阻性無精子癥患者；(2)低促性腺激素綜合征患者；(3)高泌乳素血癥患者；(4)AZFa區(qū)或AZFb區(qū)缺失患者；(5)配偶卵巢功能衰竭患者。30例NOA患者中，特發(fā)性無精子癥患者20例，克氏綜合征患者4例，AZFc區(qū)缺失患者5例，雙側(cè)隱睪固定術(shù)后患者1例。

1.2 治療方法

1.2.1 MD-TESE手術(shù):采取硬膜外麻醉，取陰囊正中縱向切口，依次切開皮膚、肉膜及鞘膜，暴露并擠出一側(cè)睪丸，避開血管沿睪丸赤道線水平橫行切開白膜，充分暴露睪丸組織，置于手術(shù)顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司，型號(hào)：YZ20T4)下仔細(xì)觀察各個(gè)區(qū)域，用鑷子逐個(gè)區(qū)域認(rèn)真分離和探查，如發(fā)現(xiàn)發(fā)育較好、管壁較厚、飽滿的曲細(xì)精管，則將其完整牽拉或切除，置于盛有Quinn 1006精子洗滌液的培養(yǎng)皿內(nèi)送至男科實(shí)驗(yàn)室，由專業(yè)技術(shù)人員采用機(jī)械法粉碎后在倒置顯微鏡(×400)下尋找精子。如未找到精子，同法探查另一側(cè)睪丸。仔細(xì)檢查無出血后用6-0微蕎線連續(xù)縫合白膜，將睪丸復(fù)位，依次逐層縫合手術(shù)切口。如雙側(cè)睪丸均未發(fā)現(xiàn)精子者，將獲得的曲細(xì)精管組織繼續(xù)在培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后再次觀察有無精子。

1.2.2 保存睪丸精子：采用稀少精子凍存技術(shù)冷凍保存睪丸精子。把機(jī)械法粉碎的曲細(xì)精管混合物轉(zhuǎn)入200 μL的EP管中，室溫下200 g離心5 min，去上清，加入1 ∶1稀釋的Quinn 8020精子冷凍液，輕輕震蕩混勻，在液氮面4～5 cm處熏蒸4 min，直接置入液氮保存，并做好標(biāo)識(shí)、登記。

1.2.3 ICSI治療:共有10對(duì)夫婦實(shí)施ICSI治療。女方按常規(guī)方法采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑長方案或加尼瑞克拮抗劑方案促排卵，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，于當(dāng)晚注射人絨毛膜促性腺激素5 000～10 000 IU，34～36 h后取卵。按常規(guī)方法用雙腔取卵針穿刺雙側(cè)卵巢，超聲引導(dǎo)下吸取卵泡。將獲得的卵泡液置于體式鏡(×10)下，獲取卵冠丘復(fù)合物，將卵冠丘復(fù)合物置入Quinn受精液[含5%人血清白蛋白的1020(SAGE，美國)]中培養(yǎng)，2～4 h后去除顆粒細(xì)胞；同時(shí)將丈夫凍存的睪丸精子復(fù)蘇，復(fù)蘇成功后用于MⅡ期卵子ICSI治療，16～18 h后觀察有明顯雙原核和雙極體者判斷為正常受精卵，則移入Quinn卵裂液[含10%血清蛋白代用品的1026(SAGE，美國)]中培養(yǎng)，于第3天移入Quinn囊胚培養(yǎng)液[含10%血清蛋白代用品的1029(SAGE，美國)]中培養(yǎng)至移植。

1.3 觀察指標(biāo) MD-TESE術(shù)后，觀察患者睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平。觀察行ICSI術(shù)患者受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率。隨訪至分娩，記錄流產(chǎn)、早產(chǎn)、足月產(chǎn)、嬰兒健康或畸形等情況。(1)優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：卵裂速度正常，細(xì)胞大小均一或略有不均，形狀基本規(guī)則，碎片≤20%，第2天無多核現(xiàn)象。(2)妊娠：胚胎移植后常規(guī)使用地屈孕酮和黃體酮軟膠囊支持，移植后14 d檢測(cè)血β人絨毛膜促性腺激素，確定是生化妊娠；移植后5周行B超檢查，如發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)有孕囊及心管搏動(dòng)者確定為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 獲精情況 30例NOA患者均實(shí)施MD-TESE手術(shù)，獲得精子13例，獲精率為43.3%(13/30)。其中特發(fā)性無精子癥患者獲精率為50.0%(10/20)，克氏綜合征患者獲精率為50.0%(2/4)，AZFc區(qū)缺失患者獲精率為20.0%(1/5)，雙側(cè)隱睪固定術(shù)后獲精率為0%(0/1)。

2.2 MD-TESE術(shù)后不同結(jié)局患者相關(guān)觀察指標(biāo)對(duì)比 根據(jù)MD-TESE術(shù)后是否獲得精子將30例患者分為獲精組13例和非獲精組17例，兩組患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 獲精組與非獲精組患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素、睪酮水平比較(x±s)

2.3 ICSI治療結(jié)果 13例獲得精子患者中共10對(duì)夫婦施行ICSI治療。MⅡ期卵子數(shù)為7～17(10.9±4.0)個(gè)，受精率為(74.8±15.7)%，優(yōu)質(zhì)胚率為(41.2±17.5)%，臨床妊娠率為70.0%(7/10)；有4例足月分娩5名健康嬰兒，3例早期稽留流產(chǎn)，見表2。

表2 ICSI治療結(jié)果

3 討 論

NOA患者根據(jù)其促性腺激素水平可分為低促性腺激素性、正常促性腺激素性和高促性腺激素性三種類型。低促性腺激素性NOA常見的病因有特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退癥和Kallmann綜合征，患者可通過內(nèi)分泌治療恢復(fù)自身生育力；正常促性腺激素性NOA大多數(shù)病因不明，部分患者與 Y 染色體微缺失有關(guān)，臨床病理主要表現(xiàn)為睪丸生精阻滯；高促性腺激素性NOA臨床較常見，病因包括：(1)先天因素，如無睪癥、隱睪癥、Klinefelter綜合征等；(2)獲得性因素，如外傷、睪丸扭轉(zhuǎn)、精索靜脈曲張、炎癥、藥物、放射線和腎衰竭等；(3)特發(fā)性因素，即由不明原因所致。后兩種類型NOA尚無明確有效的藥物治療方法，患者大多選擇使用“供精”助孕或領(lǐng)養(yǎng)的方式獲得后代。

Palermo等[7]于1992年首次應(yīng)用ICSI技術(shù)治療男性不育獲得成功，使NOA患者獲得自己的遺傳學(xué)后代成為可能。Devroey等[8]研究表明，通過手術(shù)獲取 NOA 患者的睪丸精子，結(jié)合ICSI技術(shù)可使卵子成功受精，從而使NOA患者獲得遺傳學(xué)后代。NOA患者獲取睪丸精子最初是采用睪丸取精手術(shù)，主要包括睪丸切開取精術(shù)和睪丸細(xì)針穿刺抽吸術(shù)。1998年Schlegel等[3-4]首次報(bào)告在手術(shù)顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)NOA患者睪丸組織有少部分發(fā)育較好的曲細(xì)精管，其中存在局灶的生精區(qū)域。隨后，MD-TESE手術(shù)作為一種新的睪丸取精術(shù)式不斷應(yīng)用于NOA患者的臨床治療，并取得較好的臨床結(jié)局。相較于傳統(tǒng)的睪丸取精手術(shù)，MD-TESE手術(shù)可借助手術(shù)顯微鏡能夠區(qū)別不同的生精小管，避免“盲目”取精對(duì)睪丸產(chǎn)生損傷，同時(shí)提高獲精率，更具針對(duì)性和高效性。Schlegel[4]對(duì)563例NOA患者共行684次MD-TESE手術(shù)，獲精率為61%，臨床效果滿意。越來越多的研究證實(shí)，與傳統(tǒng)睪丸取精術(shù)相比，MD-TESE手術(shù)可有效幫助NOA患者確定睪丸內(nèi)是否存在精子，可提高獲精率，降低手術(shù)并發(fā)癥，是目前最為有效的NOA患者外科取精技術(shù)[9]。

本組30例NOA患者均施行MD-TESE手術(shù)，結(jié)果獲得精子13例，獲精率為43.3%，獲精組與非獲精組患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平比較均無差異(均P>0.05)，提示MD-TESE術(shù)獲精與否與患者年齡、睪丸體積、促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平無關(guān)。Ishikawa等[10]采用MD-TESE聯(lián)合ICIS治療1 275例NOA和隱匿精子癥患者，共進(jìn)行1 323次MD-TESE手術(shù)，獲精率為42.5%，且獲精率與患者促卵泡激素、黃體生成素和睪酮水平均不相關(guān)，與本研究結(jié)果相一致。NOA患者的睪丸體積能否作為預(yù)測(cè)MD-TESE手術(shù)獲精率的指標(biāo)尚存在爭議。Golpi等[11]研究發(fā)現(xiàn)，睪丸體積≥12 mL時(shí)，NOA患者獲精率為61.11%，8 mL≤睪丸體積<12 mL時(shí)，獲精率為48.21%,睪丸體積<8 mL時(shí)，獲精率為42.19%,提示睪丸體積大則獲精率高。但趙連明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，NOA患者睪丸<8 mL時(shí)獲精率為57.4%(58/101)，睪丸體積>10 mL時(shí)獲精率為31.6%(24/76)。Ramasamy等[13]研究認(rèn)為，睪丸體積大小并不是預(yù)測(cè)MD-TESE手術(shù)獲精率的指標(biāo)，小睪丸可能只代表精子發(fā)生不良，但無法預(yù)測(cè)局灶性生精小管的存在。本研究結(jié)果提示，獲精組與非獲精組患者睪丸體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示睪丸體積可能不是MD-TESE手術(shù)獲精率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

雖然NOA患者行MD-TESE手術(shù)成功獲取精子，但患者夫婦能否生育還取決于ICSI治療結(jié)果。本文有10例獲得精子的患者采用復(fù)蘇的睪丸精子實(shí)施ICSI治療，受精率為(74.8±15.7)%，優(yōu)胚率為(41.2±17.5)%，臨床妊娠率為70.0%(7/10)，其中4例足月順產(chǎn)5個(gè)健康嬰兒，3例早期稽留流產(chǎn)，表明采用NOA患者復(fù)蘇的睪丸精子實(shí)施ICSI治療，能夠獲得較高的受精率和臨床妊娠率。Aydin等[14]研究證實(shí)，NOA患者與梗阻性無精子癥患者施行MD-TESE手術(shù)獲取睪丸精子后實(shí)施ICSI治療,兩者受精率、臨床妊娠率相似。本研究有7例獲得臨床妊娠，結(jié)果有3例自然流產(chǎn)，因此應(yīng)該重視NOA患者的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)與患者夫婦做好溝通，在其充分知情同意的前提下實(shí)施治療。

綜上所述，MD-TESE手術(shù)可幫助NOA患者確定睪丸內(nèi)是否存在精子，獲精率高。MD-TESE聯(lián)合ICSI治療NOA能獲得較好的臨床結(jié)局，是NOA患者生育遺傳學(xué)后代的有效治療方式。