伊犁野核桃內(nèi)抑菌抗氧化內(nèi)生真菌的分離、篩選和鑒定

讓鳳菊 任艷利 張維 歐陽(yáng)艷

（1. 伊犁師范大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū)教育廳天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，伊寧 835000；2. 伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，伊寧 835000）

當(dāng)今，從藥用植物中篩選生物活性成分或先導(dǎo)化合物成為研制新藥的有效途徑之一，但人類對(duì)藥用植物需求量日益增大，致使許多藥用植物開采過度，瀕臨滅絕。植物內(nèi)生菌的出現(xiàn)為藥用植物新資源的研究開拓了一條新思路［1]。近年研究顯示，內(nèi)生菌不僅具有促進(jìn)植物體的生長(zhǎng)，抗菌、抗病蟲害等功能，還能參與植物次生代謝成分的轉(zhuǎn)化合成，甚至獨(dú)立合成與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物［2]。因此，利用植物資源分離和篩選產(chǎn)活性物質(zhì)的內(nèi)生菌，用于生產(chǎn)新型活性物質(zhì)，以期研制高效、環(huán)保的新藥，即可解決某些藥用植物生長(zhǎng)緩慢，資源緊缺等引起的藥源匱乏，耐藥致病菌的發(fā)生等問題，還可保護(hù)植物生態(tài)，開發(fā)植物內(nèi)生菌資源。

伊犁野核桃屬胡桃科（Juglan daceae）山核桃屬（Carya）落葉喬木，屬典型的藥、食兩用植物。生長(zhǎng)于天山支脈北坡植物生長(zhǎng)緩慢，資源緊［3]，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)的野生植物。核桃屬植物中主要含有黃酮類、蒽醌類、酚類等多種化學(xué)成分［4]，具有抗腫瘤、抑菌及抗氧化等活性作用［5]。近年關(guān)于伊犁野核桃內(nèi)真菌生物學(xué)方面［6-7]研究備受關(guān)注，而對(duì)伊犁野核桃內(nèi)生真菌研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以伊犁野核桃研究對(duì)象，分離其內(nèi)生真菌并對(duì)高活性菌株鑒定，以期為伊犁野核桃新的藥用資源的利用供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 野核桃采自鞏留縣野核桃溝，經(jīng)生物系張維教授鑒定為伊犁野核桃。

1.1.2 供試菌株 核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、番茄灰霉菌（Bontrvtis cinerea）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄固體培養(yǎng)基（PDA）；察氏培養(yǎng)基；核桃汁培養(yǎng)基：瓊脂粉20 g，野核桃葉浸提液200 mL，加水定容至1 000 mL。

1.1.4 主要試劑 無(wú)水乙醇、Tris堿、Tris-HCI、CTAB、氯仿、異戊醇、瓊脂糖等分析純?cè)噭┚?gòu)于天津福晨化學(xué)試劑廠，DPPH購(gòu)于長(zhǎng)城生物化學(xué)工程有限公司。

1.1.5 儀器 瓊脂糖凝膠電泳儀：美國(guó)伯樂公司，HT30；立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠，Y-2000型；高速冷凍離心機(jī)HC-3018R：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀C-1000TM均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 伊犁野核桃內(nèi)生真菌的分離及保存 把野核桃根、莖、葉、果皮、果仁切成約1 cm×0.5 cm的組織塊，依次用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次，8%次氯酸鈉浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3次，分別接種到PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基和核桃浸提液培養(yǎng)基（各加入1‰青霉素和鏈霉素，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)）中，最后一遍無(wú)菌水涂布于空白培養(yǎng)基，檢驗(yàn)植物表面是否消毒徹底。28℃培養(yǎng)3-7 d，待材料邊緣長(zhǎng)出菌絲后，菌絲尖端接種法接至新PDA培養(yǎng)基，2-3次純化后，每菌轉(zhuǎn)接3支斜面培養(yǎng)基（其中一支用甘油封存，長(zhǎng)期保存），于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性篩選

1.2.2.1 初篩瓊脂塊法［8]（1）病原細(xì)菌的檢測(cè) 將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，150 r/min培養(yǎng)12 h，用無(wú)菌水稀釋至最終濃度為106CFU/mL。取100 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，用打孔器取直徑0.5 cm內(nèi)生真菌菌餅，均勻接種于培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)12 h后，測(cè)定供試菌株的抑菌圈大小，每種重復(fù)3次。（2）供試菌株的檢測(cè) 采用兩點(diǎn)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)［9]測(cè)定內(nèi)生真菌對(duì)供試菌株的抑制作用，將已活化的內(nèi)生真菌和病原真菌接種于同一個(gè) 90 mm PDA平板中，2個(gè)接種點(diǎn)中心對(duì)稱，相距40 mm，每組處理重復(fù)3次。于28℃下恒溫培養(yǎng)。對(duì)照組不接種內(nèi)生真菌，測(cè)定處理組供試菌株菌落生長(zhǎng)半徑和對(duì)照組病原菌生長(zhǎng)半徑。采用公式（1）計(jì)算供試真菌生長(zhǎng)抑制率。

其中，r對(duì)照為對(duì)照組供試菌株菌落生長(zhǎng)半徑，單位mm；r處理為處理組供試菌株菌落生長(zhǎng)半徑單位為mm。

1.2.2.2 復(fù)篩-濾紙片擴(kuò)散法［10]（1）待測(cè)菌株發(fā)酵液制備 將初篩的13株內(nèi)生真菌，分別接種于盛有200 mL PDL培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于28℃，150 r/min培養(yǎng)2周左右，用8層紗布過濾，將真菌發(fā)酵液濃縮至原體積的1/3，加入等體積乙酸乙酯超聲萃取3次，每次20 min，合并乙酸乙酯萃取液，40℃減壓蒸干，用少量甲醇重新溶解，繼續(xù)減壓旋蒸約1.5 mL，過0.22 μm的濾膜后，定容至2 mL，菌株發(fā)酵液，4℃冰箱備用。（2）發(fā)酵液抑菌活性測(cè)試 用移液槍取8 μL發(fā)酵液于滅菌濾紙片，微風(fēng)吹干，置于放有病原菌的平板，每個(gè)板3個(gè)重復(fù)，同時(shí)以甲醇作空白對(duì)照，分別置于28℃和37℃培養(yǎng)，十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.3 發(fā)酵物抗氧化能力的檢測(cè) 對(duì)13種抑菌活性較好的野核桃內(nèi)生真菌進(jìn)行抗氧化測(cè)試，取一定濃度真菌發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，篩選高抗氧化活性菌株［11]

1.2.4 野核桃內(nèi)生真菌的5.8S rDNA基因序列分析 選取抑菌活性較強(qiáng)內(nèi)生真菌，采用CTAB法提取活性菌株DNA模板［12]。選通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。將菌株的ITS序列信息輸入GenBank進(jìn)行BLAST分析，MEGA軟件聚類分析，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育數(shù)，再結(jié)合形態(tài)根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》［13]對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

2 結(jié)果

2.1 野核桃內(nèi)生真菌的分離

從野核桃中共分離純化到49株內(nèi)生真菌（表1），其中PDA培養(yǎng)基得內(nèi)生真菌27株，核桃汁培養(yǎng)基比較少，14株，察氏培養(yǎng)基僅8株。由表1知，分離出的野核桃內(nèi)生真菌數(shù)量在各組織中分布有差別：莖＞根＞葉＞果皮＞果仁，莖分離的最多（24株），占總數(shù)的48.75%，根次之22.45%，果仁和內(nèi)果皮兩次都沒有分離到內(nèi)生菌。

表1 內(nèi)生真菌分離結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.2 內(nèi)生真菌對(duì)供試菌株抑菌活性初篩

首先用瓊脂塊法進(jìn)行初篩。前人研究表明，抑菌活性分為弱：抑菌圈直徑d≤1 cm；較強(qiáng)：1 cm＜d＜1.4 cm；強(qiáng)：d＞1.4 cm三個(gè)等級(jí)（真菌：抑制率 ≥ 75%為強(qiáng)，抑菌率為 50%-75%較強(qiáng)拮抗能力，抑制率 ＜50% 為弱）［14]。

由表2知49株野核桃內(nèi)生真菌中50%以上的菌株對(duì)3種指示細(xì)菌抑菌性較強(qiáng)，表明野核桃內(nèi)生真菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜抑菌性。其中有41株內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用顯著，達(dá)83.67%；而對(duì)供試真菌的抑菌活性相對(duì)較弱，其中有2株對(duì)油菜菌核菌表現(xiàn)抑菌作用較強(qiáng)，占總數(shù)的4.08%，而對(duì)番茄灰霉抑菌作用弱。

表2 四十九株野核桃內(nèi)生真菌對(duì)5種供試菌株的拮抗作用

2.3 內(nèi)真生菌的乙酸乙酯萃取液對(duì)供試菌株的抑菌性實(shí)驗(yàn)

對(duì)初篩的13株內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)（表3，圖1），結(jié)果顯示：（1）大部分內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取液與其瓊脂塊抑菌效果一致，但個(gè)別內(nèi)生真菌的瓊脂塊與其萃取液抑菌效果差異大，如YHT-12的瓊脂塊抑菌直徑均大于1.4 cm，其萃取液的抑菌直徑均小于1.4 cm，可能產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，或者是萃取液處理過程使其失活可進(jìn)一步研究。（2）不同內(nèi)生真菌對(duì)4種供試菌株抑制效果差別較大，其中YHT-6和YHT-4最為突出，抑菌指數(shù)均大于10，對(duì)3種指示細(xì)菌的抑菌直徑都大于1.4 cm，對(duì)油菜核盤菌抑菌率大于50%；（3）不同內(nèi)生真菌對(duì)同一病原菌抑制效果也不同，其中對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)抑制作用的菌株數(shù)量最大，13株內(nèi)生菌中有12株對(duì)其有抑制作用，抑菌響應(yīng)指數(shù)達(dá)33。對(duì)油菜核盤菌的抑制效果較差，抑菌響應(yīng)指數(shù)僅為10。

表3 十三株內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取液對(duì)4種供試菌株的抑制作用

圖1 野核桃內(nèi)生真菌YHT-4菌株和乙酸乙酯萃取液抑菌圖

2.4 野核桃內(nèi)生真菌發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

清除DPPH自由基模型是一種應(yīng)用廣泛的快速評(píng)估抗氧化活性的方法，由圖2知，13株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液對(duì)DPPH自由基清除能力差異明顯，大多數(shù)菌株的乙酸乙酯萃取液對(duì)DPPH·PPH·能力差異明顯，大多數(shù)菌株8株內(nèi)生真菌的乙酸乙酯萃取液清除率超過50%，菌株YHT-4的乙酸乙酯萃取液對(duì)DPPH·PPH·萃取液達(dá)93.82%，接近Vc（95.95%）；而菌株YHT-43的EFFEA對(duì)DPPH·的清除率最低，為21.42%。可見，半數(shù)以上野核桃內(nèi)生真菌具有良好的清除DPPH·自由基能力，菌株YHT-4抗氧化活性較強(qiáng)。

圖2 野核桃菌株發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液對(duì)DPPH自由基的清除率

2.5 抑菌活性菌株YHT-4的鑒定

菌株YHT-4具有較強(qiáng)的抑菌、抗氧化能力，且遺傳性狀穩(wěn)定，對(duì)其培養(yǎng)鑒定。由圖3可見，菌株YHT-4在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，于28℃培養(yǎng)6 d后，其菌落直徑接近9 cm，菌落厚而突起，生長(zhǎng)較快，菌絲初生白色長(zhǎng)而蓬松，后期菌落中部變?yōu)榉凵?，菌落邊緣白色，不?guī)則；菌絲分枝，有隔，孢子無(wú)色，多孢，略彎，兩端稍尖。參照《真菌鑒定手冊(cè)》發(fā)現(xiàn)菌株YHT-4與鐮刀菌（Fusarium tricinctum）的形態(tài)特征相似。

由測(cè)序結(jié)果知，內(nèi)生真菌YHT-4的PCR擴(kuò)增的DNA片段為524 bp，提交至GenBank得登錄號(hào)為MH754650，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，內(nèi)生真菌YHT-4在鐮刀菌屬中的遺傳距離與Fusarium tricinctum在一個(gè)分枝上，即兩者遺傳距離最近，故初步判斷菌株YHT-4為屬于Fusarium tricinctum（三線鐮刀菌）。

圖3 菌株YHT-4顯微照片

圖4 菌株YHT-4系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖

3 討論

植物內(nèi)生真菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中與宿主植物形成共生互利關(guān)系。實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)生真菌可產(chǎn)生具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等與宿主植物相似活性的代謝產(chǎn)物。因此，植物內(nèi)生真菌為尋找安全新型藥提供了潛在的資源［15-16]。本研究從伊犁野核桃各組織中共分離出內(nèi)生真菌49株，通過抑菌和抗氧化測(cè)試篩選出一株具有較強(qiáng)的抑菌和抗氧化性活性菌株YHT-4，其對(duì)4種供試菌株具有較強(qiáng)抑制作用，抑菌指數(shù)均大于10，抑菌直徑大于1.4 cm；同時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)93.82%，接近Vc（95.95%）；最后該菌株被鑒定為三線鐮刀屬。菌株YHT-4展現(xiàn)出一定的開發(fā)價(jià)值，表明伊犁野核桃的內(nèi)生真菌中蘊(yùn)含豐富的抑菌抗氧化菌株資源。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，鐮刀屬真菌廣泛分布于植物體內(nèi)和土壤中，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化等生物活性。鐮刀菌屬為栽培核桃的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌屬［17]，劉澤星等［14]從栽培核桃分離出鐮刀菌的發(fā)酵產(chǎn)物含有較多的活性物質(zhì)，具有廣泛的抑菌活性。Tiwari等［18]研究顯示，從毛姜黃分離出的內(nèi)生真菌中，鐮刀菌具有較好的抗氧化活性。

有研究表明，三線鐮刀菌在特定條件下代謝產(chǎn)生T-2毒素，T-2毒素可對(duì)人和動(dòng)物的多個(gè)組織器官包括血液、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生毒性效應(yīng)［19]。近年實(shí)驗(yàn)報(bào)道，T-2毒素可明顯抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Wu等［20]報(bào)道了當(dāng)T-2毒素作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞時(shí)最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。可見，雖然T-2毒素具有一定毒性，也因此展現(xiàn)了在腫瘤治療中潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此需要進(jìn)一步確定菌株YHT-4 的抗氧化及抑菌活性成分，并對(duì)其使用安全性進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法從伊犁野核桃中分離到49株內(nèi)生真菌，通過抑菌活性篩選，得到抑菌活性菌株YHT-4，其發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌的抑菌直徑均大于1.4 cm，對(duì)油菜核盤菌的抑菌率達(dá)70.92%；其清除DPPH自由基能力與Vc相當(dāng)。形態(tài)學(xué)與分子學(xué)鑒定為三線鐮刀菌。