基于LAMP的好氧反硝化菌篩選及其反硝化性能

李秋芬 劉啟臣 徐愛(ài)玲 張艷 宋志文

（1. 青島理工大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，青島 266033；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071）

近年來(lái)，隨著氮素污染物的過(guò)量排放導(dǎo)致的水體富營(yíng)養(yǎng)化日益嚴(yán)重，利用生物脫氮技術(shù)去除水體中氮素污染物已經(jīng)成為最經(jīng)濟(jì)有效、且無(wú)二次污染的熱點(diǎn)生物技術(shù)之一。生物脫氮理論認(rèn)為，水體中氮素的去除主要利用微生物將有機(jī)氮經(jīng)過(guò)氨化、硝化、反硝化作用還原為NO、N2O和N2，才能徹底去除水體中的氮素污染物［1]?？梢?jiàn)反硝化過(guò)程是富營(yíng)養(yǎng)化水體凈化整個(gè)脫氮過(guò)程最后且最關(guān)鍵的一步。研究參與反硝化過(guò)程的微生物不僅利于廢水的生物脫氮、土壤肥力的保存，而且對(duì)于臭氧氣層的保護(hù)，減少N2O氣體的排放均具有重要的意義［2]。因此篩選出具有反硝化功能的微生物至關(guān)重要。

反硝化主要途徑為硝酸鹽在周質(zhì)硝酸鹽還原酶Nap或膜質(zhì)硝酸鹽還原酶Nar的作用下還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在亞硝酸鹽還原酶Nir的作用下還原為NO，NO在亞硝酸鹽氧化還原酶Nor的作用下還原為N2O，N2O在氧化亞氮還原酶Nos的作用下還原為N2［3]。目前，已有報(bào)道對(duì)反硝化菌的篩選大多基于底物消除法，以硝酸氮和亞硝酸氮的減少作為反硝化細(xì)菌存在的依據(jù)［4]。但是，有些異養(yǎng)菌會(huì)通過(guò)同化作用吸收硝酸氮和亞硝酸氮，轉(zhuǎn)化成細(xì)胞物質(zhì)，這樣即使檢測(cè)到兩種底物的減少，而不一定轉(zhuǎn)化成氣體。還有報(bào)道在此基礎(chǔ)上，通過(guò)氣體產(chǎn)生檢測(cè)或利用編碼反硝化酶的功能基因的PCR檢測(cè)作為篩選條件［2，5]。但是PCR檢測(cè)方法對(duì)反應(yīng)條件要求高，如果條件不合適，會(huì)出現(xiàn)假陰性，而氣體檢測(cè)常用的氣相色譜法操作繁瑣、費(fèi)用高［6]。2000年，日本研究人員Notomi等［7]報(bào)道的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的體外擴(kuò)增DNA技術(shù)，即用2對(duì)（或3對(duì)）特殊引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下（60-65℃），完成核酸擴(kuò)增的一種生化方法［8-9]。LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物可以采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度分析法、HNB指示劑法進(jìn)行檢測(cè)［9]。由于其產(chǎn)物是大小長(zhǎng)短不一的重復(fù)序列，因此可以觀察到大小不同的階梯條帶；又因?yàn)閺膁NTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物（焦磷酸鎂）形成乳白色沉淀，可通過(guò)肉眼觀察判定擴(kuò)增與否［10]，也可以通過(guò)加入 SYBR Green Ⅰ［11]、GeneFinder［11]等核酸染料進(jìn)行終點(diǎn)直接觀察。反應(yīng)能在1 h內(nèi)完成，具有快速、簡(jiǎn)易、高特異性及不依賴(lài)于昂貴檢測(cè)設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)［12]。如 Yano等［13]使用 LAMP對(duì)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)；Zhong等［14]使用LAMP對(duì)臨床樣本中的人類(lèi)乳頭狀瘤病毒進(jìn)行檢測(cè)；Ferrara等［15]使用LAMP法對(duì)純培養(yǎng)的青霉菌進(jìn)行檢測(cè)。然而通過(guò)LAMP方法同時(shí)利用反硝化酶的功能基因nirS、nirK和nosZ快速篩選反硝化菌株的研究報(bào)道尚未見(jiàn)到。為此，本研究通過(guò)選擇nirS基因、nirK基因和nosZ基因作為靶序列［16]設(shè)計(jì)小于500 bp特異性LAMP引物，結(jié)合PCR驗(yàn)證和產(chǎn)氣檢測(cè)，建立了快速、簡(jiǎn)便的產(chǎn)N2好氧反硝化菌篩選方法，從運(yùn)行良好的海水養(yǎng)殖循環(huán)水系統(tǒng)的生物濾池中分離篩選到了5株性能良好的目標(biāo)反硝化菌株，旨在為污廢水的脫氮治理提供一種高效、便捷的好氧反硝化菌株篩選方法和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 樣品于2018年10月取自位于青島市即墨區(qū)的中國(guó)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)遺傳育種基地的南美白對(duì)蝦種蝦培育系統(tǒng)的生物濾池。該濾池對(duì)氨氮和亞硝酸氮的去除效果良好，使養(yǎng)殖系統(tǒng)的氨氮和亞硝酸氮維持在0.2 mg/L以下。取濾池水樣和掛膜材料分別置于100 mL血清瓶中，低溫保存，快速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑和儀器 試劑：TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、LAMP體系試劑購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司、PCR試劑購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；所用國(guó)產(chǎn)化學(xué)藥品均為分析純，采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。儀器：SIGMA 3-18K高速冷凍離心機(jī)（Sigma，德國(guó)）；梯度PCR儀（Eppendorf，德國(guó)）；MF-chemiBIS 3.2化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)（DNR，以色列）；超微量核酸蛋白分析儀（Biodropsis Bo-1000，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；testo 510數(shù)字式壓差儀（0-100 hPa，德國(guó)儀器國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：參照孫雪梅［1]并有所改進(jìn)：MgSO4·7H2O 0.1 g，NaH2PO40.2 g，K2HPO40.5 g，CaCO31 g，F(xiàn)eSO40.1 g，NaNO32.47 g，（NH4）2SO42 g，葡萄糖（孔徑0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌）1.25 g，過(guò)濾后的陳海水1 000 mL（固體培養(yǎng)基則加入2%瓊脂粉），pH 7.4-7.8，121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。

分離培養(yǎng)基［17]：KNO31.2 g、檸檬酸鈉 5 g，K2HPO41 g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素［18]（EDTA 2.06 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.54 g，MnCl·4H2O 0.2 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·5H2O 0.02 g，Na2MnO40.1 g，CoCl·6H2O 2 mg，蒸餾水1000 mL）2 mL，蒸餾水1 000 mL（固體培養(yǎng)基則加入2%瓊脂粉），pH 7.4-7.8，121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。

產(chǎn)氣測(cè)試培養(yǎng)基［19]：檸檬酸鈉 5 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素 2 mL，KNO31.2 g，KNO21.2 g，（NH4）2SO40.008 g，蒸餾水 1 000 mL（固體培養(yǎng)基則加入2%瓊脂粉），pH 7.4-7.8，121℃ 高壓蒸汽滅菌 20 min。

反硝化能力測(cè)試培養(yǎng)基［19]：檸檬酸鈉 5 g，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，微量元素2 mL，KNO31.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.4-7.8。121℃高壓蒸汽滅菌 20 min。亞硝酸氮去除測(cè)試培養(yǎng)基則將KNO3分別替換為KNO2，各形態(tài)氮含量為50 mg/L，其余條件不變。

1.2.2 菌株富集與分離 將帶回實(shí)驗(yàn)室的水樣恒溫振蕩30 min，在無(wú)菌條件下，將40 mL無(wú)菌海水加入盛掛膜材料的血清瓶中，恒溫振蕩1 h，然后取10 mL接入到90 mL無(wú)菌0.85%的生理鹽水中，恒溫振蕩15 min。

取10 mL振蕩液接種于液體富集培養(yǎng)基中，于28℃、180 r/min好氧條件下振蕩培養(yǎng)5 d，重復(fù)轉(zhuǎn)接3-4次后，取10 mL 富集液進(jìn)行系列梯度稀釋?zhuān)∵m當(dāng)倍數(shù)稀釋液100 μL均勻涂布于分離培養(yǎng)基上，放于28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48-72 h，根據(jù)菌落特征挑選不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)劃線分離4-5次，直至得到純的單菌落，13株候選菌株分別編號(hào)為KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KFDX5、KFDX6、KFDX7、KWDX1、KWDX2、KWDX3、FJ3-1、FJ3-2 和 FJ6-1。

1.2.3 好氧反硝化菌株的LAMP初步篩選 基因組DNA提取，取分離到的13株菌株的保存菌種分別加入到2216E液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下過(guò)夜培養(yǎng)。取培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提取，方法按照TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法。將得到的基因組DNA片段，使用微量DNA定量?jī)x進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)，然后將產(chǎn)物進(jìn)行分裝，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

LAMP引物設(shè)計(jì)，根據(jù)GenBank公布的nirS（序列號(hào)：BAK92488.1）基因、nirK（序列號(hào)：AP012279.1）基因和nosZ（序列號(hào)：KT877014.1）基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4（http：//primerexplorer.jp / elamp4.0.0）設(shè)計(jì)多組基因nirS、nirK和nosZ的LAMP引物，經(jīng)優(yōu)化后，選用引物序列見(jiàn)表1，然后由金唯智生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。

表1 LAMP用引物序列

LAMP反應(yīng)體系，低溫條件下，先將樣品模板與引物充分混合。然后，配制擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：10×等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)緩沖液 2.5 μL、MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL、dNTP Mix（10 mmol/L）3.5 μL、FIP/BIP Primers（25×）1 μL、F3/B3 Primers（25×）1 μL、Bst 2.0 DNA聚合酶（8 000 U/mL）1 μL、DNA Sample 1 μL、滅菌水補(bǔ)充至 25 μL，再將10×GeneFinderTM核酸染料4 μL點(diǎn)在離心管盒蓋內(nèi)側(cè)用封口膜封口，放置60℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)60 min。檢測(cè)過(guò)程中以特定的反硝化標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，以ddH2O代替菌株作為陰性對(duì)照。

LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增后的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物采用添加GeneFinderTM核酸染料顯色液進(jìn)行直接觀察的方式：水浴60 min后，將盒蓋上的染料輕輕彈下混勻后，用肉眼直接觀察顏色變化，呈熒光綠的為陽(yáng)性，仍呈橙色的為陰性。

1.2.4 菌株的PCR二次篩選 為了防止通過(guò)LAMP篩選的含nirS基因或nirK基因和nosZ基因的反硝化菌株存在假陽(yáng)性，而采用PCR進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和篩選。PCR引物為nirS-3F：5'-CCGCACCCGGGBCG-YGG -3'；nirS-6R：5'-CGTTGAACTTRCCGGT-3'［18]；nirK-1F ：5'- GGMATGGTKC -CSTGGCA-3'；nirK-5R ：5'- GGMATGGTKCCSTGGCA-3'［19]；nosZ-F：5'-CGYTGTTCMTCGA- CAGCCAG-3'；nosZ-1622R：5'-CGCRASGGCAASAAGGTSCG -3'［18]。反應(yīng)體系（50 μL）為：Premix LA Tap 25 μL、Primers（25×）0.4 μL、模板 2 μL、ddH2O 補(bǔ)充至 50 μL。PCR 程序如下：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，：72℃延伸30 s；循環(huán)30次，最后72℃延伸 5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.5 菌株的產(chǎn)氣檢測(cè) 三次篩選 將二次篩選出來(lái)的反硝化菌株接種到500 mL反硝化能力測(cè)試培養(yǎng)基，然后將錐形瓶放進(jìn)帶有氣體表盤(pán)和接有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氣體數(shù)據(jù)的顯示器的密閉性testo 510數(shù)字式壓差儀氣罐中，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。每間隔12 h觀察一次N2氣體產(chǎn)生情況，然后總結(jié)最后篩選結(jié)果。

1.2.6 菌株的反硝化性能測(cè)定 在含有1.0 g/L葡萄糖（過(guò)濾滅菌）的條件下、保持氮添加量為50 mg/L的水平，分別配制亞硝酸氮和硝酸氮的去除測(cè)試液，每組做3個(gè)平行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液將接種量控制在 1. 8 × 106- 1. 9 × 106CFU/mL 范圍內(nèi)，置于28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng).每隔 12 h 取一次樣，測(cè)定NO2-N和NO3-N的值，每次同時(shí)測(cè)定各測(cè)試液的OD600值。

無(wú)機(jī)氮的分析方法參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》（GB17378. 4-2007）［1]，亞硝酸氮的測(cè)定采用鹽酸萘乙二胺分光光度法；硝酸氮的測(cè)定采用鋅-隔還原法。菌體生長(zhǎng)量采用吸光度法，用可見(jiàn)分光光度計(jì)于 600 nm 處測(cè)量吸光度值（OD600）。

2 結(jié)果

2.1 菌株的LAMP初步篩選

利用建立的LAMP方法對(duì)分離獲得的13株反硝化候選菌株進(jìn)行初步篩選。如圖1-A所示，由nirS基因作為靶基因的LAMP體系反應(yīng)產(chǎn)物與GeneFinderTM核酸染料反應(yīng)后，可以發(fā)現(xiàn)其中菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、FJ3-1 和 FJ3-2顏色變?yōu)闊晒饩G，結(jié)果為陽(yáng)性；其余7株反應(yīng)液顏色為橙色，結(jié)果為陰性。如圖1 -B所示，由nirK基因作為靶基因的LAMP體系反應(yīng)60 min后，可以觀察有菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2 等7株顏色變?yōu)闊晒饩G，結(jié)果為陽(yáng)性；6株篩選的反硝化菌株反應(yīng)液顏色為橙色，結(jié)果為陰性。如圖1-C所示，由nosZ基因作為靶基因的LAMP體系反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化，其中，菌 株 KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和 FJ3-2等5株顏色變?yōu)闊晒饩G，結(jié)果為陽(yáng)性；其余8株為橙色，結(jié)果為陰性。通過(guò)LAMP法對(duì)3種反硝化相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果，可看出菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2同時(shí)含有nirS或nirK和nosZ基因，可初步認(rèn)定為反硝化菌。

圖1 分別以nirS、nirK、nosZ基因?yàn)榘谢虻腖AMP產(chǎn)物直接觀察結(jié)果

2.2 PCR二次篩選

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LAMP法篩選的菌株的準(zhǔn)確性，以上述初步篩選出的菌株的DNA為模板，分別用PCR引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。分別由nirS基因、nirK基因、nosZ基因作為靶基因的PCR體系反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

由nirS基因作為靶基因的檢測(cè)結(jié)果（圖2-A）顯 示：7株 菌 株 中，KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、FJ3-1、FJ3-2等6株菌株有清晰條帶，表明該6株菌株含有nirS基因。與LAMP體系的結(jié)果一致。由nirK基因作為靶基因的檢測(cè)結(jié)果（圖2-B）顯示：7株菌株都有清晰條帶，該結(jié)果表明7株菌株都含有nirK基因。與由nirK基因作為靶基因LAMP體系的結(jié)果一致。由nosZ基因作為靶基因的檢測(cè)結(jié)果（圖2-C）顯示：7株菌株中，只有KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2等5株菌株有清晰條帶，表明該5株菌株含有nosZ基因。與由nosZ基因作為靶基因LAMP的結(jié)果一致。采用PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，陽(yáng)性菌與通過(guò)LAMP方法篩選的結(jié)果一致。由此證明，本研究構(gòu)建的LAMP篩選體系簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)有效且特異性高靈敏度強(qiáng)，可以用于快速篩選目標(biāo)菌株。

圖2 以初篩菌株nirS、nirK、nosZ基因?yàn)榘谢虻腜CR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

2.3 反硝化菌株的產(chǎn)氣檢測(cè)篩選

將初步篩選到的7株菌株接種到500 mL產(chǎn)氣測(cè)試培養(yǎng)基中，然后將錐形瓶放進(jìn)帶有氣體表盤(pán)和接有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氣壓數(shù)據(jù)的顯示器的密閉性testo 510數(shù)字式壓差儀氣罐中，28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。結(jié)果如表2所示，菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2等6株菌株有氣體產(chǎn)生。

綜合3步篩選，確認(rèn)KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2為目標(biāo)產(chǎn)N2的好氧反硝化菌株。

表2 七株菌株的產(chǎn)氣結(jié)果

2.4 菌株的反硝化性能測(cè)試結(jié)果

將7株菌在添加葡萄糖、以亞硝酸鉀為氮源的測(cè)試液中連續(xù)培養(yǎng) 72 h，如圖3-A所示，除菌株KFDX1的OD600值一直在0.5左右，其余菌株生長(zhǎng)迅速，12 h即達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，亞硝酸氮濃度迅速下降，如圖3-B 所示，7株菌對(duì)亞硝酸氮的去除均降到1 mg/L以下，7株菌株對(duì)亞硝酸氮的去除速率均在3.8 mg/（L·h）以上。隨著菌體的繁殖，48 h之后菌體生長(zhǎng)緩慢，亞硝酸氮去除速率變慢，開(kāi)始趨于平緩；72 h后，7株菌株均將亞硝酸氮降到0.5 mg/L以下，去除率高達(dá)99%。其中，菌株KFDX2去除最快，速率為3.91 mg/（L·h）、，72 h后達(dá)到最大去除率為99.04%；菌株KWDX1次之，去除速率為3.90 mg/（L·h）、72 h后最大去除率為99%；菌株FJ3-1去除速率最低，為2.63 mg/（L·h）、36 h后最大去除率也達(dá)到了99%。數(shù)據(jù)表明，篩選出含nosZ基因的菌株 KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2對(duì)亞硝酸氮的降解效果和降解速率都優(yōu)于不含nosZ基因的菌株KFDX4、FJ3-1。

將 7 株菌在添加葡萄糖、以硝酸鉀為氮源的測(cè)試液中連續(xù)培養(yǎng) 72 h，如圖4-A、圖4-B 所示，12 h 后，KFDX3、KFDX4、FJ3-1、FJ3-2 菌體迅速生長(zhǎng)，菌株KFDX1、KFDX2 12 h后才快速生長(zhǎng)并迅速去除硝酸氮。菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、FJ3-2對(duì)硝酸氮的最大去除速率分別可達(dá)到 2.1633 mg/（L·h）、3.824 mg/（L·h）、3.773 7 mg/（L·h）、4.031 2 mg/（L·h）、3.595 8 mg/（L·h）。12-48 h 內(nèi)，菌體生長(zhǎng)達(dá)到平臺(tái)期，對(duì)硝酸氮的利用也趨于平緩。KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1、FJ3-2對(duì)硝酸氮的去除效果良好，去除率高達(dá)90%以上。其中菌株FJ3-2對(duì)硝酸氮12 h的降解率最大為98.02%，去除速率為3.595 8 mg/（L·h）；另外發(fā)現(xiàn)篩選出來(lái)的含nosZ基因的菌株KFDX2、KWDX1和FJ3-2對(duì)硝酸氮濃度的降解效果和降解速率優(yōu)于不含nosZ基因的菌株FJ3-1。有趣的是菌株KFDX1、KFDX2、KWDX1和FJ3-1測(cè)試液中硝酸鹽氮濃度先上升，后下降，其原因有待進(jìn)一步研究。

圖3 七株菌在亞硝酸氮環(huán)境中的菌量變化和去除效果

圖4 七株菌在硝酸氮環(huán)境中的菌量變化和去除效果

3 討論

常規(guī)的反硝化菌的篩選大多是通過(guò)設(shè)計(jì)運(yùn)行能提供兼性厭氧條件的生物反應(yīng)器輔助底物測(cè)定，周丹丹等［20]通過(guò)污泥馴化、測(cè)總氮和氮元素軌跡跟蹤法篩選好氧反硝化細(xì)菌；梁賢等［21]從馴化成熟的SBR反應(yīng)器中篩選反硝化菌株。也有報(bào)道是通過(guò)普通的培養(yǎng)基和溫度條件加以PCR檢測(cè)篩選反硝化菌株；馮雅麗等［22]通過(guò)富集分離從深海沉積物中篩選出反硝化菌。熊焰等［23]從養(yǎng)殖水體中通過(guò)常規(guī)檢測(cè)和16S rRNA序列分析鑒定反硝化菌株。這些研究方法都需要繁瑣的實(shí)驗(yàn)過(guò)程、特定嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)環(huán)境、昂貴專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)儀器，不利于實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確篩選。合適的DNA靶標(biāo)序列是分子鑒定和檢測(cè)的基礎(chǔ)［24]，本研究在好氧富集、分離的基礎(chǔ)上，基于反硝化系列酶編碼基因nirS、nirK和nosZ的序列，建立了篩選好氧反硝化菌株的LAMP初篩技術(shù)和產(chǎn)氣檢測(cè)二篩技術(shù)。由于直接針對(duì)反硝化反應(yīng)最后一步需要的氧化亞氮還原酶編碼基因—nosZ基因的序列，設(shè)計(jì)了 LAMP特異引物，可以直接篩選到產(chǎn)N2的反硝化菌株，避開(kāi)了產(chǎn)溫室氣體NO2或N2O的反硝化菌株。同時(shí)該體系只需要在60℃下恒溫條件下反應(yīng)1 h，而且反應(yīng)結(jié)果通過(guò)添加核酸染料，用肉眼直接觀察顏色的變化再加上簡(jiǎn)單的壓差儀可直接測(cè)出氣體的產(chǎn)生，不需要任何專(zhuān)業(yè)的精密的儀器如PCR儀、氣相色譜等昂貴的儀器［24]。因此本研究建立的LAMP反應(yīng)體系可實(shí)現(xiàn)快速篩選，操作方便、經(jīng)濟(jì)、靈敏［25]，可以更高效、更準(zhǔn)確地篩選好氧反硝化菌株，用于工業(yè)廢水、生活污水及水產(chǎn)養(yǎng)殖高氮水的凈化，為今后反硝化菌株的研究提供了便捷的途徑，豐富了脫氮處理污廢水的理論，推動(dòng)好氧反硝化細(xì)菌的分離及其反硝化性能的研究與應(yīng)用［26-27]。

好氧反硝化細(xì)菌的分離及其反硝化性能的研究與應(yīng)用得到了迅速發(fā)展［26-27]，了解好氧反硝化細(xì)菌的反硝化特性利于反硝化的深入研究，進(jìn)而可以?xún)?yōu)化污廢水生物脫氮工藝、優(yōu)化升級(jí)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。熊焰等［23]分離篩選的反硝化菌SZ-3在28℃、96 h對(duì)亞硝酸氮的降解率為91.78%；張崢［28]等從柳鋼焦化廢水A/O系統(tǒng)中篩選的好氧反硝化細(xì)菌f-3在36 h對(duì)硝酸氮去除率為92.85%，亞硝氮去除率為68.45%。而本研究從南美白對(duì)蝦種蝦培育系統(tǒng)的生物濾池通過(guò)LAMP方法篩選出5株好氧反硝化菌，在好氧條件下24 h對(duì)亞硝酸氮去除率就達(dá)到了99%，硝酸氮去除率為90%。最高去除速率可分別達(dá) 到 3.91 為 mg/（L·h）、4.0312 mg/（L·h）；明顯高于前述已報(bào)道的菌株。實(shí)驗(yàn)表明利用LAMP方法以是否含有nosZ基因作為標(biāo)準(zhǔn)篩選出來(lái)的含nosZ基因的菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2對(duì)亞硝酸氮和硝酸氮的降解效果和降解速率優(yōu)于不含該基因的菌株KFDX4、FJ3-1；同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菌株KFDX4對(duì)硝酸氮的去除率很高，但未檢測(cè)到nosZ基因，也不產(chǎn)氣，可能是通過(guò)同化作用利用了硝酸氮，而不是反硝化反應(yīng)；菌株FJ3-1中未檢測(cè)到nosZ基因，但檢測(cè)到有氣體產(chǎn)生，可能該菌株是產(chǎn)NO2或N2O的反硝化菌株。另外，菌株FJ3-1等在硝態(tài)氮環(huán)境里不利用硝態(tài)氮，反而促進(jìn)硝態(tài)氮濃度的升高，其原因還需要進(jìn)一步研究。

雖然環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是，由于LAMP具有極高的靈敏性，極易產(chǎn)生假陽(yáng)性，所以在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中必須保證無(wú)菌環(huán)境，減少空氣中氣溶膠的產(chǎn)生。本試驗(yàn)在無(wú)菌條件下一次性完成，將GeneFinderTM核酸染料點(diǎn)在離心管的內(nèi)蓋上，然后離心管用封口膜封好，待反應(yīng)結(jié)束后不打開(kāi)反應(yīng)管的蓋子，將事先加在盒蓋上的染料輕輕彈下，直接觀察顏色變化，避免了氣溶膠擴(kuò)散到空氣中，為后續(xù)LAMP反應(yīng)試驗(yàn)創(chuàng)造無(wú)菌環(huán)境，減少因假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)而影響LAMP檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性［29-30]。

4 結(jié)論

建立的LAMP體系在60℃下反應(yīng)60 min，通過(guò)GeneFinderTM核酸染料染色直接觀察法從南美白對(duì)蝦種蝦培育系統(tǒng)的生物濾池中快速準(zhǔn)確地篩選出7株同時(shí)含有nirS基因或nirK基因和nosZ基因的好氧反硝化菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KFDX4、KWDX1、FJ3-1和FJ3-2；再進(jìn)行PCR驗(yàn)證和產(chǎn)氣測(cè)試，最終確定5株可產(chǎn)N2的好氧反硝化菌KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1 和 FJ3-2。

篩選出來(lái)的含nosZ基因的菌株KFDX1、KFDX2、KFDX3、KWDX1和FJ3-2對(duì)亞硝酸氮和硝酸氮的降解效果良好，對(duì)和的去除率分別達(dá)到99%和90%以上，最大去除速率分別可高達(dá) 4.9 mg/（L·h）和 4.03 mg/（L·h）。降解速率優(yōu)于不含該基因的菌株KFDX4、FJ3-1。