堆肥過程中纖維素降解菌的分離與鑒定

李林超 張超 董慶 郭成 周波，2 高崢

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 . 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271000；2. 土肥資源高效利用國家工程實(shí)驗(yàn)室，泰安 271000）

農(nóng)業(yè)固體廢棄物是指在整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中被丟棄的有機(jī)類物質(zhì)，主要包括秸稈、尾菜和畜禽糞便等［1]。中國已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出量最大的國家，而絕大數(shù)農(nóng)業(yè)廢棄物沒有作為一種資源利用，隨意丟棄或者通過焚燒排放到環(huán)境中，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了極大影響［2]。研究農(nóng)業(yè)固廢棄物處理現(xiàn)狀及發(fā)展路徑是解決環(huán)境問題、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的重要手段［3]。農(nóng)業(yè)固體廢棄物是有機(jī)固體廢棄物的重要組成部分，目前主要通過填埋、焚燒、熱解、沼氣工藝和好氧堆肥等方式對(duì)其進(jìn)行資源化處理［4]。

秸稈好氧堆肥是在有氧條件下將有機(jī)物質(zhì)通過微生物的作用分解成腐殖質(zhì)并形成穩(wěn)定產(chǎn)品的過程［5]。堆肥是目前一種廣泛使用的通過微生物群落降解有機(jī)質(zhì)的方法，從堆肥中獲得的堆肥產(chǎn)品含有作物必須的營養(yǎng)物質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)，可作為土壤改良劑改善土壤結(jié)構(gòu)。其中微生物在這個(gè)過程中起著至關(guān)重要的作用［6]。

雖然堆肥中的土著微生物群落通常能成功進(jìn)行堆肥，但是因?yàn)樵撨^程進(jìn)行的速率與能夠作用于木質(zhì)纖維素的微生物的比例直接相關(guān)，所以木質(zhì)纖維素的降解成為影響堆肥腐熟時(shí)間的主要限速步驟［7]。木質(zhì)纖維素中的纖維素是一種難以降解的物質(zhì)，不易被微生物利用。然而有的微生物則可以分泌幾種類型的纖維素酶，包括纖維素酶、外切葡聚糖酶（如FPase）和木聚糖酶等［8]。大量研究表明，接種可以分泌纖維素酶的外源微生物，如細(xì)菌和真菌，可以加速堆肥過程中纖維素的生物降解［9]。

劉曉梅［10]采用纖維素剛果紅水解圈法、濾紙條降解實(shí)驗(yàn)和纖維素酶活力測定，在杏鮑菇菌渣中篩選出3株高效降解纖維素的菌株（BC11、BC12、FB7），經(jīng)分子鑒定FB7為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；BC12為叢毛單胞菌屬（Comamonassp.）的一種；BC11為白色鏈霉菌（Streptomyces albus）。Han［11]以纖維素為唯一碳源從咖啡外果皮分離得到38株細(xì)菌和18株放線菌，并對(duì)所分離的菌株進(jìn)行了纖維素酶活的測定，從中優(yōu)選出了酶活性較高的菌株。目前分離的具有纖維素降解能力的細(xì)菌較多，主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單孢菌屬（Pseudomones）、梭菌屬（Clostridium）、纖維單孢菌屬（Cellulomonas）［6，12]。目前已知能有效利用纖維素的放線菌主要有纖維放線菌（Actinomyces cellμlosae）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、熱單孢菌屬（Thermomonospora）等［10]，然而，當(dāng)前纖維素降解菌株的積累仍然不足，農(nóng)業(yè)固態(tài)廢棄物依然在世界各地造成一定的污染和資源浪費(fèi)。為滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中農(nóng)業(yè)固態(tài)廢棄物無害化、資源化的需要，亟待挖掘更多更為高效的纖維素降解菌株資源。

本研究擬以玉米秸稈為材料進(jìn)行好氧堆肥，旨在通過堆肥過程有針對(duì)性地選擇馴化纖維素降解菌株，進(jìn)一步依此堆肥產(chǎn)物對(duì)其中優(yōu)勢纖維素降解菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，以期篩選獲得具有高效纖維素降解能力的菌株。本研究擬豐富纖維素降解菌株資源，并檢測菌株活性指標(biāo)，旨在為下一步菌株在秸稈好氧堆肥過程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采集泰安地區(qū)玉米秸稈堆肥樣品，將其放冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 CMC培養(yǎng)基羧甲基纖維素鈉（CMCNa）10.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，CaCl20.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL；剛果紅培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，（NH4）2SO4 1.0 g，剛果紅0.1 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水1 000 mL；復(fù)篩培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g，KH2PO41.0 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.01 g，蒸餾水 1 000 mL；濾紙降解培養(yǎng)基：（NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g， 酵 母 膏0.1 g，濾紙條（1 cm×6 cm）3條/三角瓶，蒸餾水1 000 mL；；保藏培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，瓊脂 20.0 g，蒸餾水 1 000 mL；秸稈降解培養(yǎng)基：小麥秸稈烘干剪成1 cm左右的段狀，段狀秸稈10 g，赫氏奇無機(jī)鹽培養(yǎng)液1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化 活化菌種 取1 g堆肥樣品用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取10-4，10-5，10-6梯度的稀釋液100 μL涂布于CMC-Na培養(yǎng)基平板上，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 d，根據(jù)以CMC-Na為唯一碳源的培養(yǎng)基中菌落的直徑來初步評(píng)估菌株對(duì)纖維素的降解利用效果，選取直徑較大的菌株進(jìn)行分離純化；待生長旺盛后用1 mg/mL剛果紅染色劑染色20 min后，棄去染液，加入1 mol/L氯化鈉溶液，洗滌1-2 min，保留降解圈較大的纖維素降解菌，測量菌落直徑（d）和降解圈直徑（D），通過計(jì)算D/d的值來確定纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株；三區(qū)劃線純化并保存。

1.2.2 菌種鑒定 菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定：將純化后的菌株活化，用無菌牙簽挑取適量菌苔，在CMC-Na平板上，進(jìn)行三區(qū)劃線，于28℃下倒置培養(yǎng)3-5 d，至平板上長出清晰菌落，觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀透明度及菌落顏色等形態(tài)特征。生理生化測定參照東秀珠編《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［13]。

分子鑒定［14]：將有3株纖維素降解菌進(jìn)行DNA的提取，以其為模板，以16S rDNA通用引物27F和1 492R引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到1.5 kb的基因片段，將測序序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果將所得基因的序列利用MEGA7.0進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 纖維素酶活的定量測定 將3株菌的單菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后取出500 μL接種于50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)1 d后，每天定時(shí)取樣測定發(fā)酵液的酶活力，連續(xù)測定5 d。

粗酶液制備：將上述產(chǎn)酶培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)的液體發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心15 min后，取上清液即為粗酶液。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：葡萄糖與木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：向7個(gè)25 mL具塞試管中分別依次加入1.6 mL、1.5 mL、1.4 mL、1.3 mL、1.2 mL、1.1 mL和l.0 mL，pH5.5的磷酸緩沖液，同樣依次加入1 mg/mL的葡萄糖與木聚糖溶液0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL和1.0 mL，最后每個(gè)試管中均加入3 mL的DNS，用Excel表格繪制葡萄糖與木聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力按國際單位的定義是：每分鐘催化水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位U。

酶活力的測定：將1 mL的1%CMC-Na、1%木聚糖溶液和2片1×1 cm的濾紙片分別加入到25 mL具塞試管中，37℃水浴10 min，再加入1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，搖勻，于此溫度下準(zhǔn)確反映30 min后，迅速加入DNS試劑3 mL，在沸水浴中煮沸5 min，流水沖洗迅速冷卻，用蒸餾水定容到25 mL，在540 nm波長測吸光值，對(duì)照管中添加熱滅活酶液［15]。

1.2.4 濾紙崩解實(shí)驗(yàn) 使用三角瓶液體發(fā)酵的方法研究各菌株的降解效果。每個(gè)三角瓶分裝100 mL產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基并加入3條1×6 cm的濾紙條，以不接菌作為空白對(duì)照，其余處理加入待測菌株的菌懸液，混勻后置于恒溫培養(yǎng)，定期觀察濾紙條的形態(tài)變化。

1.2.5 秸稈降解 將3株菌株分別按1%的比例接種至小麥秸稈段無機(jī)鹽液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，以接種等量無菌水為空白對(duì)照，在搖床溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下液體發(fā)酵7 d。液體發(fā)酵降解結(jié)束后，將稻稈降解殘余物在100目的過濾網(wǎng)內(nèi)用大量清水沖洗，除去附著菌體和可溶性物質(zhì)，在105℃條件下烘干至恒重，同時(shí)稱取秸稈剩余物干重，計(jì)算降解率。秸稈相對(duì)降解率=（m0-m1）/m0×100%（m0為對(duì)照組秸稈剩余物干重，m1為處理組秸稈剩余物干重）。

2 結(jié)果

2.1 菌種的分離和純化

以玉米秸稈堆肥樣品，利用剛果紅染色法初步獲得43個(gè)具有纖維素降解功能的分離物。將分離得到的分離物經(jīng)剛果紅平板實(shí)驗(yàn)得到透明圈，通過計(jì)算透明圈和菌落直徑的比值（D/d）來初步測定降解纖維素能力較強(qiáng)的菌株。通過測量得到12株降解能力較大的菌株（表1）。

2.2 濾紙崩解實(shí)驗(yàn)

由于菌株的降解纖維素的能力體現(xiàn)在分泌纖維素酶的綜合酶活力水平上，所以實(shí)驗(yàn)采用濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)篩，根據(jù)濾紙最終降解的程度來篩選優(yōu)勢菌株，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1），在培養(yǎng)3 d條件下，菌株GD16可以完全將濾紙條降解為糊狀，菌株C31可將濾紙條崩解為近似糊狀，菌株C37可將濾紙崩解為不定形狀，菌株C42和T5C2效果稍差，可將濾紙條邊緣崩解。與對(duì)照相比，這5株菌均具有崩解濾紙的效果，其中菌株菌株GD16和C31的崩解效果十分顯著，而且僅3 d就可以將濾紙條完全降解，保存菌株C31、C37和GD16用作接下來的實(shí)驗(yàn)。

表1 纖維素降解菌初篩結(jié)果

圖1 濾紙崩解實(shí)驗(yàn)效果圖

2.3 菌種鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化分析 將3株菌株于CMC-Na平板上三區(qū)劃線，待長出單菌落后，觀察菌落形態(tài)。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)菌株C31在平板上（圖2-A）呈圓形，表面干燥，菌落為灰色。中央環(huán)狀凹陷，外緣有同心輪紋，邊緣略呈不規(guī)則波紋狀。革蘭氏染色結(jié)果為陽性（圖2-B）。生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，接觸酶、葡萄糖反應(yīng)為陽性，明膠液化、解淀粉反應(yīng)為陰性。菌株C37在CMC-Na培養(yǎng)基上單菌落形態(tài)（圖2-C）為扁平、圓形，表面干燥，菌落為白色。革蘭氏染色結(jié)果為陰性（圖2-D）。

表2 纖維素降解菌生理生化特征

圖2 纖維素降解菌的菌落形態(tài)和革蘭氏染色

生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，能利用淀粉、乳糖和蔗糖等碳源。菌株GD16在LB平板（圖2-E）上呈白色，革蘭氏染色呈陽性（圖2-F），桿菌，接觸酶、解淀粉反應(yīng)呈陽性。孔雀綠染色（圖2-G）顯示產(chǎn)芽孢，桿菌，接觸酶、解淀粉反應(yīng)呈陽性。

2.3.2 纖維素降解菌的分子生物學(xué)鑒定 根據(jù)比對(duì)結(jié)果將所得基因的序列利用MEGA7.0進(jìn)行多重序列比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）發(fā)現(xiàn)，C31與放線菌（Streptomyces drozdowiczii）相似性最高，C37與黃麻鏈霉菌（Streptomyces corchorusii）親緣關(guān)系較近，GD16經(jīng)鑒定與類芽孢桿菌（Paenibacillus pabuli）親緣關(guān)系較近。

將濾紙條崩解實(shí)驗(yàn)得到的3株菌，采用DNS法測定菌株的產(chǎn)木聚糖酶活性、濾紙酶活性和纖維素酶活性（圖4）。由結(jié)果可知，C31的3種酶最大酶活性均相對(duì)較高分別為8.5 U/mL、4.8 U/mL和3 U/mL，GD16的3種纖維素相關(guān)酶活中的木聚酶活性相對(duì)較高，高達(dá)23 U/mL，而菌株C37的3種纖維素相關(guān)酶活均較低，分別為2.5 U/mL、3 U/mL和2.3 U/mL。

2.4 酶活的定量測量

圖3 纖維素降解菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 不同菌株不同纖維素酶活

圖5 不同菌株纖維素酶活變化

菌株C31、菌株C37 和菌株GD16的纖維素酶活變化趨勢呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖5）。在第4天時(shí)3個(gè)菌株的纖維素酶活均達(dá)到最大，分別為2.3 U/mL、3 U/mL 和 2.3 U/mL。其中菌株C31纖維素酶活上升速度相對(duì)較快，而菌株GD16的纖維素酶活相對(duì)于菌株C31和菌株C37較低。

在整個(gè)培養(yǎng)過程中，菌株C31、C37和GD16濾紙酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖6），其中菌株GD16的濾紙酶活性在第3天達(dá)到最大值2.3 U/mL，菌株C37和菌株C31的濾紙酶活性在第4天達(dá)到最大值，分別為2.5 U/mL和3 U/mL。

菌株C31、菌株C37和菌株GD16的木聚糖酶活變化與它們的濾紙酶活性和纖維素酶活變化趨勢相似，即先增后降（圖7）。菌株GD16的酶活在第2天達(dá)到最大，為23 U/mL，C31和C37分別在第5天和第4天達(dá)到最大值分別為8.5 U/mL、3 U/mL。

2.5 秸稈相對(duì)降解率

為直觀評(píng)價(jià)3株菌對(duì)秸稈的降解能力，對(duì)3株菌的秸稈降解率測定結(jié)果如圖8所示。其中菌株C31的秸稈降解能力在3株菌中表現(xiàn)最優(yōu)，其在無機(jī)鹽秸稈發(fā)酵培養(yǎng)基中28℃條件下培養(yǎng)7 d后，秸稈降解率達(dá)20%；其次為C37，其秸稈相對(duì)降解率為9%。GD16的秸稈降解率與C37相近，為8.2%。

圖6 不同菌株濾紙酶活變化

圖7 不同菌株木聚糖酶活變化

圖8 不同菌株秸稈相對(duì)降解率

3 討論

具有纖維素降解功能的微生物在堆肥效率方面起著至關(guān)重要的作用，其中放線菌在堆肥過程中的微生物群落中也發(fā)揮著重要的作用［16]。盡管放線菌的生長速度比細(xì)菌慢，但放線菌可能具有更重要的特性。例如，耐熱性和對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)性等［17]。本研究從秸稈堆肥樣品中篩選得到了3株纖維素降解菌株，其中有2株放線菌和1株類芽孢桿菌。這也證明了放線菌具有降解纖維素的能力。此外，孫曉萌等［18]證實(shí)了放線菌將木質(zhì)纖維素分解成可溶性碳水化合物的能力。并且鏈霉菌屬微生物分泌的纖維素酶與木聚糖酶的pH耐受性和溫度穩(wěn)定性最好，這些酶在堿性、高溫環(huán)境中仍然具有較高酶活。細(xì)菌菌株一般是以大規(guī)模的繁殖來表現(xiàn)其自身的生物降解作用，同時(shí)是和多種微生物菌株的共同作用，才能實(shí)現(xiàn)較好的秸稈降解效果［19]。細(xì)菌酶活力較低，但細(xì)菌在厭氧條件下產(chǎn)生的纖維素酶在中、堿性環(huán)境下發(fā)揮作用，正好與有氧條件下真菌產(chǎn)生的偏酸性纖維素酶互補(bǔ)。此外，芽孢桿菌因具有較好的耐堿、耐高溫、耐酸能力而受到研究者的普遍關(guān)注［20]。本研究篩選得到的GD16是一株可產(chǎn)芽孢的類芽孢桿菌，豐富了纖維素降解菌資源，為纖維素降解菌在秸稈堆肥中的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

為了提高接種效率，一般用于堆肥的接種物通常選擇具有一種或幾種酶能力的菌株組成［21]。本研究對(duì)這3株菌進(jìn)行了濾紙酶活性、纖維素酶活性和木聚糖酶活性連續(xù)5 d的定量測量。結(jié)果顯示這3株纖維素降解菌都具有3種纖維素降解酶活，但是在不同酶活的大小卻有所差異，在纖維素酶活中，菌株C31的纖維素酶活是最大的，可達(dá)到4.8 U/mL；其次是C37和GD16，分別為3.0 U/mL、1.9 U/mL。在濾紙酶活中，C31的濾紙酶酶活是最大的，可達(dá)到3 U/mL。在木聚糖酶活中GD16的木聚糖酶酶活性最大，高達(dá)23 U/mL。這可能也是菌株GD16在濾紙崩解實(shí)驗(yàn)中效果最好的原因。此外，王賢豐等［22]從海水中篩選出高效甘蔗渣纖維素降解地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），纖維素酶活力達(dá)到2.80 U/mL；陳珊等［23]從長白山森林的土壤中篩選出一株纖維素降解菌，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，纖維素酶活力為1.82 U/mL。本研究篩選得到的3株菌在纖維素酶活方面均高于這2株地衣芽孢桿菌。表明本研究所篩選的菌株具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

本研究中對(duì)篩選的纖維素降解菌進(jìn)行了秸稈相對(duì)解率的測定，通過秸稈降解率的測量可以更加直接的觀察菌株實(shí)際的應(yīng)用情況，結(jié)果顯示菌株C31的秸稈降解率均高于菌株C37和菌株GD16，這也與纖維素酶活測定結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

4 結(jié)論

針對(duì)蔬菜廢棄物好氧堆肥的特點(diǎn)從自然界中篩選優(yōu)良的纖維素降解菌。采用篩選培養(yǎng)基對(duì)不同樣品進(jìn)行纖維素降解菌株分離，獲得具有纖維素降解能力的菌株。通過羧甲基纖維素鈉水解圈法、濾紙條崩解試驗(yàn)和纖維素酶活測定等對(duì)獲得的菌株復(fù)篩，獲得3株高效纖維素降解菌株，經(jīng)鑒定菌株C31為放線菌、菌株C37為黃麻鏈霉菌，菌株GD16為類芽孢桿菌。