水環(huán)境微生物溯源技術的研究和應用進展

許又分 李宗 劉如銦 余志晟 張洪勛 何煒 李燁

（1. 中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100049；2. 北京市環(huán)境保護科學研究院，北京 100037；3. 國家地質實驗測試中心，北京100037）

養(yǎng)殖廢水和生活污水的隨意排放會導致水體的糞便污染。糞便中含有大量對人體有害的病原微生物，能夠引起腹瀉和急性腸胃炎等疾?。?]。許多糞源病原體可以在體外環(huán)境水體中大量生長繁殖，從而導致病原微生物的水源性傳播［2-3]。目前，通常用糞便指示細菌（Fecal indicator bacteria，F(xiàn)IB），如大腸桿菌（Escherichiacoli）、糞大腸菌群（Fecal coliforms）等來評估地表水體的糞便污染水平［4]。但有研究表明FIB與糞便污染的關聯(lián)度并不高［5]；并且，F(xiàn)IB的宿主特異性較差，不能提供有關污染源的信息［6]。準確的污染源定位對于污染防治工作至關重要。源于這個需求，各種污染溯源方法逐漸發(fā)展起來。微生物溯源（Microbial source tracking，MST）技術出現(xiàn)在20世紀后期，主要用于區(qū)分糞便污染的宿主來源［7]。因飲食結構和消化系統(tǒng)不同，不同動物消化道內的微生物表型或者基因型之間存在差異［8]，MST技術即利用這種差異建立污染源指示物與動物宿主之間的特異性關系，進而來判斷糞便污染源。近年來，MST技術以其客觀性、低成本、檢測速度快和結果準確等優(yōu)點受到普遍關注［9-10]。美國環(huán)境保護署（U.S. Environmental protection agency，EPA）已將MST技術應用于最大日負荷總量（Total maximum daily load，TMDL）方案制定過程中［11]。盡管如此，MST技術在實際應用過程中仍然存在地區(qū)差異性和標準化等問題。

目前有多種源指示微生物可用于MST，如雙歧桿菌（Bifidobacterium）和擬桿菌（Bacteroides）等，但合適的源指示微生物及其相關檢測方法的選擇是開展地表水環(huán)境糞便污染溯源的關鍵。根據(jù)檢測通量的不同，可將MST方法分為單源指示物法和多源指示物法兩類。本文圍繞兩大類MST方法，重點綜述了不同類型的指示微生物及其常用的檢測方法，包括原理、優(yōu)缺點等，并簡要總結了MST技術在TMDL方案制定過程中的實際應用以及討論了MST技術目前所面臨的問題與挑戰(zhàn)，最后對MST技術的發(fā)展趨勢進行展望，以期促進MST技術在我國的應用，為我國地表水質管理工作提供支持。

1 MST基本原理

由于不同動物飲食結構、消化系統(tǒng)及體內環(huán)境條件（如pH、營養(yǎng)條件）等的不同，經過長期的協(xié)同進化，特定微生物類群在相同物種宿主腸道中通常具有類似或相同的基因型或表型，而在不同物種宿主腸道中的基因型或表型存在差異?；谠撛?，MST技術通過建立特定糞便污染指示物與動物宿主間的特異關聯(lián)來判定糞便污染來源［12]。MST所檢測的糞源指示微生物通常應符合以下幾個特征：（1）宿主特異性；（2）在體外條件下難以繁殖；（3）一定的環(huán)境耐受性；（4）濃度足以檢測［12]等。常用的糞便污染源指示物有雙歧桿菌（Bifidobacterium）、擬桿菌（Bacteroides）、脆弱擬桿菌噬菌體（Bacteroides fragilisbacteriophage）、大腸桿菌噬菌體（F+ specific RNA coliphages）和人類腸道病毒（Human enteric viruses）等［13-14]。

目前，MST方法主要用于追蹤地表水體的糞便污染來源。根據(jù)所檢測指示物通量的不同，可分為單源指示物法和多源指示物法兩大類。單源指示物法通常通過檢測單一生物標記來判定污染來源；而多源指示物法則通過分析微生物群落或多種生物標記同時鑒別多個不同的污染源。

2 MST方法

2.1 單源指示物法

2.1.1 細菌指示物法

2.1.1.1 糞便大腸菌群（Fecal coliform，F(xiàn)C）/糞便鏈球菌（Fecal streptococcus，F(xiàn)S）法 由于人類糞便中有較高數(shù)量的FC，動物糞便中含有較高數(shù)量的FS，所以，早在20世紀60年代末至70年代，有學者提出用FC與FS的比值來指示污染源。他們認為當“4＜FC/FS”時表示主要是人源糞便污染，當“FC/FS＜0.7”時表示主要是其他動物糞便污染［15-16]。之后該方法被細化為，當“4＜FC/FS”時表示主要是人源糞便污染；當“0.1＜FC/FS＜0.6”時表示主要是畜禽養(yǎng)殖排泄物造成的污染，而當“FC/FS＜0.1”時表示主要是野生動物糞便污染［17]。該方法能較快地產生結果，而且不需要很強的專業(yè)技能，但是由于FC和FS在環(huán)境水體中的生長速度和耐受性都不相同，并且兩者的比值極易受環(huán)境中的各個因素如雨水或者工業(yè)污水的排入等的影響［18]，加之大腸桿菌在環(huán)境中也是普遍存在的［19]，所以FC/FS法難以準確區(qū)分人類以及其他動物的糞便污染源。

2.1.1.2 雙歧桿菌（Bifidobacterium）法 雙歧桿菌為專性厭氧菌，在人類腸道內的濃度很高，并且在環(huán)境中難以繁殖［20]，所以通常不會出現(xiàn)在無污染的環(huán)境水體中。有些山梨醇發(fā)酵雙歧桿菌（SorbitolfermentingBifidobacteria，SFB）（如B. adolescentis和B.breve）可作為人類糞便污染的指示物［21-22]。SFB可通過用含有山梨醇的瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)鑒定［23]，但有研究表明基于SFB培養(yǎng)的MST方法的特異性并不高［24]。相比之下，利用不依賴于培養(yǎng)的分子檢測方法，主要是基于PCR的方法，能夠區(qū)分不同宿主類型中的不同雙歧桿菌基因型。例如，Balleste等［25]發(fā)現(xiàn)在人類、禽類和牛的糞便樣品中存在不同類型的雙歧桿菌16S rRNA基因片段且可作為宿主特異性基因標記來指示特定來源的糞便污染。一些研究還建立了基于宿主特異性雙歧桿菌16S rRNA基因標記的qPCR方法［26-27]（表1），能夠進一步定量區(qū)分污染來源。

2.1.1.3 大腸桿菌（Escherichia coli）法 大腸桿菌為桿狀的革蘭氏陰性細菌，主要存在于恒溫動物的腸道內，代謝類型為異養(yǎng)兼性厭氧型，可通過糞便或者生活污水進入環(huán)境［18]。長期以來，環(huán)境水域中的大腸桿菌被認為是糞便污染的指示微生物，并被EPA推薦作為淡水中的FIB［11]。大腸桿菌普遍存在于人和動物腸道內，無法簡單地通過培養(yǎng)的方法區(qū)分糞便污染源，需要結合抗生素抗性分析技術、免疫學方法或DNA指紋圖譜（如PFGE、rep-PCR、核糖體分型等）等技術以區(qū)分動物和人類的糞便污染［13，21，28]。但因攜帶于質粒上的抗生素抗性基因易受環(huán)境或培養(yǎng)條件影響而丟失、需要較大的抗血清數(shù)據(jù)庫或DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫等缺點［29-31]，基于大腸桿菌培養(yǎng)的溯源方法已很少使用。近年來多采用分子方法檢測大腸桿菌宿主特異性基因標記來鑒別糞便污染源，簡化了操作步驟［32]。例如，Khatib等［33]以大腸桿菌的STII毒力基因作為豬源糞便污染的指示物，采用PCR方法可有效地檢測環(huán)境水體中的豬源糞便污染。

2.1.1.4 擬桿菌（Bacteroides）法 擬桿菌是腸道中的主要專性厭氧菌群，因其數(shù)量多、特異性較強且在環(huán)境中難以繁殖［34]，許多研究者推薦以擬桿菌作為MST的源指示微生物。一些擬桿菌物種如脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）因只存在于人類糞便中且濃度很高，故可作為人源糞便污染的指示微生物［21]。B. fragilis主要通過培養(yǎng)的方法進行檢測以鑒別人源糞便污染，不過有研究發(fā)現(xiàn)從豬糞便中也能夠分離培養(yǎng)出B. fragilis［35]。此外，擬桿菌在環(huán)境水體中通常只能存活幾個小時，導致分離培養(yǎng)困難，因此目前基于擬桿菌分離培養(yǎng)的MST方法已不多見。相比之下，近年來基于擬桿菌宿主特異性基因標記的MST方法（通常為靶向擬桿菌16S rRNA基因片段的qPCR方法）因其較高的特異性和敏感性（表1）而得到了快速發(fā)展［36-44]。

目前，利用擬桿菌特異性基因標記能夠很好地區(qū)分人、豬和反芻動物的糞便污染源，但在禽類糞便污染的溯源研究中應用較少。需要注意的是，因研究區(qū)域不同，各個基因標記檢測污染源的敏感性和特異性會略有差別［14]。

2.1.1.5 其他細菌指示物法 除了上述常見的糞源指示細菌外，還有一些其他的糞源菌也可用于微生物溯源。例如，短桿菌（Brevibacterium）16S rRNA基因片段LA35可作為禽類糞便污染的指示物（表1）［45]；細菌Catellicoccus marimammalium16S rRNA基因片段GFC和螺桿菌（Helicobacter）16S rRNA基因片段GFD可作為鳥類糞便污染的指示物［46]；乳酸桿菌（Lactobacillales）16S rRNA基因片段Crane1可作為鶴源糞便污染指示物等［47]。

2.1.2 病毒指示物法

2.1.2.1 擬桿菌噬菌體法 有些以脆弱擬桿菌（如菌株RYC 2056）為宿主的噬菌體廣泛存在于受人類糞便污染的水體中，可以采用雙層平板進行培養(yǎng)以檢測人源糞便污染［48]。不過該方法的敏感性并不高，需謹慎使用［49]。

2.1.2.2 大腸桿菌噬菌體（F+ RNA coliphage）法F+ RNA大腸桿菌噬菌體主要分為4種類型，即型Ⅰ、型Ⅱ、型Ⅲ和型Ⅳ。其中，型Ⅱ和型Ⅲ主要與人類糞便污染有關，型Ⅳ主要與動物糞便污染有關，而型Ⅰ與人類和動物糞便污染都有關［13，49]。對于檢測到的噬菌體可以通過免疫學方法或者遺傳學方法進行鑒定，進而利用不同類型F+ RNA大腸桿菌噬菌體的宿主差異性來區(qū)分污染源［49-50]。近年來，基于分子方法（如反轉錄PCR等）來檢測4種類型F+RNA大腸桿菌噬菌體的MST方法不僅簡化了檢測過程，還提高了方法的靈敏性［51-52]。

2.1.2.3 其他病毒指示物法 除了上述病毒外，還有一些其他的病毒也可作為糞源指示物（宿主多為人類）。例如，人類多瘤病毒（HPyVs）［53]、胡椒粉斑駁病毒（PMMoV）［54]等，都可以通過分子檢測方法鑒別人源糞便污染。表1列舉了目前單源指示物法常用的基因標記及其對應的引物。

2.2 多源指示物法

2.2.1 DNA微陣列（Microarray）法 DNA微陣列又稱為DNA芯片或基因芯片，主要由硅片、玻片等材質的載體和附著其上并已知序列的基因探針分子構成。將待測樣品與DNA微陣列進行雜交，通過雜交信號的有無及強弱獲得待測樣品中微生物群落的基因組成信息［55]。近年來DNA微陣列技術在環(huán)境監(jiān)管領域日益受到關注。該方法可用于環(huán)境水體糞便污染溯源［56]，能夠高通量、快速地鑒別多種糞便污染源。但也存在特定污染源的基因指示物數(shù)據(jù)庫缺乏、成本和復雜度較高等問題。Dubinsky等［57]通過針對16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育微陣列分析識別了不同動物糞便中的特征微生物類群，并且野外試驗表明這種基于微陣列的MST方法能夠通過一次實驗追蹤多種污染來源。美國國家環(huán)境保護署（U.S.Environmental protection agency，EPA）也報道了一種采用DNA微陣列技術進行溯源的方法，該微陣列由453個探針組成，能夠檢測糞便和宿主特異的細菌、病毒、抗生素耐藥性基因以及其他與環(huán)境污染相關的基因標記，可用于娛樂水體病原菌檢測和糞便污染源鑒定［58]。

2.2.2 高 通 量 測 序（High-throughput-sequencing，HTS）法 高通量測序技術能一次對PCR擴增產物或來自環(huán)境樣品的DNA序列信息進行大規(guī)模平行分析，從而獲得海量數(shù)據(jù)。通過對微生物群落分析和開發(fā)新的MST標記，HTS-MST法提供了一個快速、有效的定性糞便污染源檢測途徑［59]，為水體糞便污染溯源帶來新的機遇。

HTS-MST方法不是依賴單個基因標記檢測或者源指示微生物的培養(yǎng)計數(shù)，而是從微生物群落的角度，更全面地解析環(huán)境水體中的糞便污染來源［60]。近年來，主要發(fā)展起來兩種HTS-MST方法：一種是經過對測序結果的聚類分析，選出某類糞便污染源（如人類和動物）特異的可操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs），或者是多個污染源共有的OTUs，再根據(jù)環(huán)境樣品的微生物群落組成特征判斷糞便污染程度和可能的污染源；另一種方法是使用基于貝葉斯算法的SourceTracker分析，通過比較環(huán)境樣品與不同動物糞便中微生物群落組成特征，進而判斷不同污染源對環(huán)境樣品微生物群落的貢獻［60]，目前已被用于鑒別環(huán)境水體的糞便污染源［61]。

3 MST的實例應用——TMDL方案

在環(huán)境管理和水質監(jiān)測方面，MST技術已經被廣泛地應用于地表水體的糞便污染鑒定及溯源，有助于管理人員針對水體污染源實施有效的治理和修復措施［62-64]。該技術可以結合TMDL方案制定流域保護措施。TMDL指水體可以接受并仍然滿足水質量標準的污染物的最大日負荷量［11]。TMDL方案是EPA推行的控制水體污染源、保護地表水環(huán)境質量的計劃和措施［65]。該方案已經開展了30多年，人們通過流域水質模擬、安全邊際估算等積累了大量的經驗，促進了水質改善和污染控制措施的實施［66]。

MST技術能夠通過準確判斷污染源以支持TMDL方案的制定和實施，具體體現(xiàn)在以下3個方面［11]：（1）源識別——在TMDL制定過程中，MST最明顯的用途是鑒別水體糞便污染源，并將結果用于TMDL分析中。（2）負荷分配分析——MST有助于識別流域中最主要的污染源，其結果可用于指導開發(fā)和選擇較可行的負荷分配方案。（3）實施方案制定——MST有助于將管理目標集中于其已確定的污染源上，促進制定相關的污染控制實施方案。

在TMDL方案的制定過程中采用MST技術，能夠根據(jù)溯源結果更加具體地分配微生物污染負荷削減任務。例如，可以根據(jù)實際情況削減農場污染排放、減少化糞池滲漏或者是污水管道泄漏等［66]。據(jù)EPA報道，美國的愛達荷州、俄勒岡州、新墨西哥州等多個地區(qū)已將MST技術應用于當?shù)氐腡MDL方案的開發(fā)和實施中，促進了當?shù)厮h(huán)境的修復［11]。

表1 單源指示物法常用的基因標記及其引物

續(xù)表

4 MST的問題

在實際應用中，MST面臨的一個主要問題是該技術存在地區(qū)差異性［14]。例如，研究發(fā)現(xiàn)在美國被推薦為人類糞便污染指示物的特異性擬桿菌基因標記HF183［67]，并不適用于印度的人源糞便污染判定［64]，并且在中國珠三角河網地區(qū)的MST適用性研究中發(fā)現(xiàn)敏感性也較低［43]；而在印度能夠有效鑒別人源糞便污染的擬桿菌基因標記BacHum［64]，在新加坡進行MST時的敏感性并不高［14]。導致MST方法地區(qū)差異性的原因主要源自宿主本身和環(huán)境因素兩個方面。

宿主方面，由于不同地區(qū)的畜禽飼養(yǎng)方式及人類飲食結構往往存在一定差異，微生物在適應不同地區(qū)的宿主腸道環(huán)境的過程中可能產生遺傳多樣性，進而使得MST指示物的表型或基因型發(fā)生變異［68]，導致MST方法在不同地區(qū)的適用性問題。Shanks等［68]在美國對7個追蹤牛糞便污染源的MST方法進行適用性評估時發(fā)現(xiàn)，由于牛糞便樣品采集于不同地區(qū)并且各地喂養(yǎng)方法不同，使MST方法在不同地區(qū)的敏感性和特異性存在顯著差異。

環(huán)境因素方面，由于指示物在不同環(huán)境條件下的衰減速率不一樣，加之環(huán)境水體成分的復雜性，從而致使MST方法在不同地區(qū)的適用性存在差異。具體來說：（1）指示物排入環(huán)境水體后因受周圍環(huán)境條件的影響而使其行為變的極其復雜，其衰減速率也是影響MST方法適用性的重要原因。許多學者針對指示物在不同環(huán)境條件下的衰減進行了相關研究，發(fā)現(xiàn)基因標記極易受環(huán)境條件的影響，如溫度越低基因標記的存在時間越長［69]，鹽度越高基因標記的衰減速度越慢［70]等。（2）環(huán)境樣品的類型及其物理和化學特征（如顆粒物、酸堿度等）直接影響MST方法的敏感性和檢測限［71-72]。環(huán)境樣品中通常含有腐殖酸等抑制物，難以在DNA提取過程中完全去除，從而可能導致PCR或qPCR檢測的敏感性降低，檢測限升高［66]。因此，在進行MST前，需要對研究區(qū)域水環(huán)境進行方法的敏感性評估，以確定方法是否受到環(huán)境樣品DNA提取物中雜質成分的抑制。

5 總結及展望

綜上所述，環(huán)境監(jiān)測和管理的需要推動了MST技術的發(fā)展。根據(jù)指示物檢測通量的不同，本文把當前的MST方法分為單源指示物法和多源指示物法兩大類。其中單源指示物法檢測速度快、操作簡單，能定量鑒別不同動物的糞便污染，但通量較低，一次只能檢測一種糞便污染；而多源指示物法能同時對多個污染源進行定性解析，但尚存在成本較高、操作較復雜、難以準確定量等不足。在實際操作中可將兩種方法聯(lián)用，以提高溯源的效率和準確性，例如可首先通過多源指示物法定性分析環(huán)境水體中的所有可能的糞便污染來源，進而使用單源指示物法定量評估特定糞源污染程度。

MST方法目前所面臨的最大挑戰(zhàn)仍然是地區(qū)差異性問題［14]，不同地區(qū)的宿主腸道菌群差異以及環(huán)境條件都可能會導致方法適用性發(fā)生改變。本課題組在評估已有的MST方法在我國華北地區(qū)的適用性時也發(fā)現(xiàn)，許多已報道的基于豬源特異性擬桿菌基因標記的MST方法的特異性并不高。因此在MST實際應用前，尤其是沒有相關地區(qū)MST方法應用報道時，需要對MST方法的適用性進行評估，充分了解其特異性、敏感性和檢測限等，以判斷方法是否適用。

目前，MST技術作為一種環(huán)境監(jiān)測手段在我國的應用還相對較少。未來應建立MST方法的標準化檢測流程，并促進MST技術在我國水質監(jiān)測和水環(huán)境保護領域的應用，以期為我國環(huán)境管理工作提供技術支持。