高效液相色譜法測定替考拉寧血藥濃度及其在重癥感染患者中的應(yīng)用

晨迪，楊昭毅，沈愛宗，張圣雨，蘇丹，寧麗娟，楊本軍

[1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科]

替考拉寧屬于糖肽類抗菌藥物，可用于治療各種嚴重的革蘭陽性菌感染，包括不能用青霉素類及頭孢菌素類抗生素治療或用上述抗生素治療失敗的嚴重葡萄球菌感染，或?qū)ζ渌股啬退幍钠咸亚蚓腥?。替考拉寧?000年12月進入國內(nèi)，因其抗菌作用強、腎毒性低等優(yōu)勢，臨床應(yīng)用日益增多，特別是腎功能不全的老年嚴重感染患者。但由于其口服不吸收，靜脈使用時血漿蛋白結(jié)合率達90%以上等特性，在特殊人群使用時，體內(nèi)血藥濃度會發(fā)生顯著變化[1-3]。因此本研究以建立替考拉寧血藥濃度監(jiān)測方法為基礎(chǔ)，分析替考拉寧血藥濃度結(jié)果，為臨床合理使用藥品，進行個體化用藥提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器 色譜儀：安捷倫1200；檢測器：二極管陣列檢測器，型號：G1365A；色譜柱：Agilent C18 色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；離心機：SIGMA，型號：D37520；旋渦混合器：IKA，型號：V2；pH計：梅特勒—托利多，型號：FE20；萬分之一分析天平：德國Sartorius，型號：CP225D；超純水機：Heal Force，型號：SMART-N。

1.2 材料 替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品：100 mg，中國食品藥品檢定研究院，批號：130374-201002；哌拉西林鈉標(biāo)準(zhǔn)品：TCI公司，批號：5C8OB-SH；乙腈：天津福晨化學(xué)試劑有限公司(20141022)；二氯甲烷:上海潤捷化學(xué)試劑有限公司(20170401)；水：自制超純水。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 精密稱取替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)品19.93 mg于10 mL容量瓶中，加入超純水溶解稀釋至刻度，充分混勻。得1.993 mg/mL的對照品儲備液。放置于冰箱中冷藏保存，備用。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取哌拉西林鈉標(biāo)準(zhǔn)品15.03 mg于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解稀釋至刻度，充分混勻。得0.15 mg/mL的對照品儲備液，放置于冰箱中冷藏保存，備用。

2.2 血漿樣品處理 血漿樣品處理辦法：精密量取400 μL血漿樣本，加入內(nèi)標(biāo)哌拉西林鈉工作溶液(0.15 mg/mL)50 μL，加入600 μL乙腈。震蕩渦旋1 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液900 μL于離心管中，加入400 μL二氯甲烷，震蕩渦旋1 min，于12 000 r/min離心5 min，取上清液于樣品瓶中，20 μL進行分析。

2.3 實驗條件建立

2.3.1 色譜條件 流動相：0.01 mol/L NaH2PO4(磷酸調(diào)pH至3.3)-乙腈(72:28)；柱溫：35°；檢測波長:240 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.3.2 專屬性考察 取空白血漿、對照品加空白血漿、患者血樣，血漿樣品后，進樣檢測。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品替考拉寧儲備溶液50 μL，加入空白血漿950 μL，配制成替考拉寧濃度為99.650 μg/mL(A)，49.825 μg/mL(B)，24.913 μg/mL(C)，12.456 μg/mL(D)，6.228 μg/mL(E)，3.114 μg/mL(F)的樣品。處理血漿樣品后進樣檢測。

2.3.4 精密度準(zhǔn)確度試驗 配制替考拉寧濃度為33.22 μg/mL(H)，11.07 μg/mL(M)，3.69 μg/mL(L)，3.114 μg/mL(F)的質(zhì)控系列血樣。分別取替考拉寧質(zhì)控濃度的400 μL血漿樣本溶液及哌拉西林鈉工作溶液(0.15 mg/mL)50 μL，配制成替考拉寧質(zhì)量控制(QC)樣品，連續(xù)測定3 d，計算QC樣品的測得濃度，計算批內(nèi)和批間的精密度準(zhǔn)確度。

2.3.5 定量下限評價 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品F(3.114 μg/mL)，處理血漿樣品后進樣檢測，觀察信噪比(S/N)是否大于10。

2.4 重癥患者血藥濃度監(jiān)測

2.4.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)治療性使用替考拉寧的成年患者；(2)感染性疾病包括以下情況之一：呼吸道感染、血流感染、導(dǎo)管相關(guān)感染、感染性心內(nèi)膜炎、中性粒細胞減少伴發(fā)熱、骨和關(guān)節(jié)感染、腹腔感染、皮膚和軟組織感染。

2.4.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 出現(xiàn)以下任意一項情況的患者應(yīng)排除：(1)非靜脈使用替考拉寧的患者；(2)預(yù)防性使用替考拉寧的患者；(3)使用替考拉寧后24 h內(nèi)死亡的患者；(4)對本品過敏或存在其他不適合使用本品的情況；(5)主動要求退出的患者。

2.4.3 給藥方案 注射用替考拉寧(賽諾菲-萬安特公司生產(chǎn))，成人劑量每次6 mg/kg或400 mg，持續(xù)滴注，前3劑，每12小時給藥1次，此后每24小時給藥1次。嚴重?zé)齻蚋腥拘孕膬?nèi)膜炎患者維持劑量可能需要達到12 mg/kg。腎功能不全患者按照說明書調(diào)整用藥劑量。

2.4.4 采血方案 準(zhǔn)確記錄用藥時間及采血時間(血樣采集時間點為第1 劑給藥后24 h和第6劑給藥前30 min)；抽取靜脈血1～2 mL，置于含EDTA的抗凝管中；靜止30 min，4000 r/min離心10 min，分離出血漿，待測。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對收集的數(shù)據(jù)進行線性回歸分析，和數(shù)據(jù)概括性度量。α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)評價

3.1.1 專屬性考察 測得色譜圖結(jié)果如圖1～3所示。空白血清中未見干擾峰，替考拉寧各組分分離且峰形較好。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以替考拉寧(TA2-2)峰面積(A替考拉寧)與內(nèi)標(biāo)峰面積(A內(nèi)標(biāo))的比值作為Y 對替考拉寧總濃度X作線性回歸分析，采用加權(quán)最小二乘法，獲得回歸方程標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.03X+0.004，r=0.9998，線性范圍是3.114～99.650 μg/mL，結(jié)果見圖4。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品色譜圖(加入內(nèi)標(biāo)溶液)

圖3 患者血漿樣品色譜圖(加入內(nèi)標(biāo)溶液)

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：以替考拉寧(TA2-2)峰面積(A替考拉寧)與內(nèi)標(biāo)峰面積(A內(nèi)標(biāo))的比值作為Y對替考拉寧總濃度X作線性回歸分析

3.1.3 精密度準(zhǔn)確度試驗 血漿樣品測定3 d，計算QC樣品的測得濃度，計算批內(nèi)和批間的精密度準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1和表2。測得替考拉寧最低定量限、低、中、高4個濃度的質(zhì)控樣品批內(nèi)、批間精密度RSD均小于15%；準(zhǔn)確度均在98.26%～111.54%之間。

表1 替考拉寧的精密度結(jié)果 (n=5,%)

表2 替考拉寧的批內(nèi)批間準(zhǔn)確度結(jié)果(n=5,%)

3.1.4 定量下限試驗 按相關(guān)要求進行試驗，定量下限(F)為3.114 μg/mL的血漿樣品經(jīng)檢測后，信噪比(S/N)顯示為17.3。

3.2 血藥濃度監(jiān)測結(jié)果 本研究納入23例患者，測定替考拉寧血藥濃度46次。23例患者中血液科有16例，ICU有4例，急診內(nèi)科有3例。女性12例，男性11例。年齡范圍20～83歲，年齡(51.91±19.39)歲。分別對第1 劑給藥后24 h和第6 劑給藥前30 min的谷濃度進行測定。

結(jié)果表明，第1次采血點替考拉寧谷濃度范圍為3.91～35.92 mg/L，不符合正態(tài)分布(P=0.032<0.05)，故使用中位值和上下四分位法描述：10.86(7.02,15.66)mg/L，變異系數(shù)62.99%。第2次采血點替考拉寧谷濃度范圍為1.5～81.7 mg/L，不符合正態(tài)分布(P=0.001<0.05)，故使用中位值和上下四分位法描述：9.33(7.30,；21.18)mg/L，變異系數(shù)100.41%。2次采血替考拉寧谷濃度均高于10 mg/L的僅9例，僅占總?cè)藬?shù)的39.13%(我國推薦的有效濃度范圍為≥10 mg/L)結(jié)果見表3。再對46例次患者濃度進一步分析，結(jié)果見表4。

表3 23例患者血藥濃度監(jiān)測一覽表

表4 替考拉寧血藥濃度分布情況[例(%)]

4 討論

4.1 血藥濃度方法學(xué)確定 替考拉寧是由5個結(jié)構(gòu)相似的化合物組成，其中TA2-2占主要成分，且大多數(shù)文獻選用并證實僅測量TA2-2與測量5個成分差異無統(tǒng)計學(xué)意義[4]。故本研究通過檢測TA2-2的濃度以代替替考拉寧的濃度。高效液相色譜法，作為測定血藥濃度的常用檢驗方法具有專屬性強、精密度高，成本低等特點而被廣泛應(yīng)用。雖然HPLC測定替考拉寧血藥濃度，國內(nèi)外均有報道，但本研究所選取的流動相和色譜條件與先前報道相比稍有不同。

與單一的乙腈沉淀蛋白相比，增加二氯甲烷萃取步驟可純化樣品，有效避免內(nèi)源性物質(zhì)的影響。本試驗的關(guān)鍵點在于血漿樣本的采集。替考拉寧作為時間依賴性抗菌藥物，治療效果和谷濃度密切相關(guān)。實際研究中監(jiān)測的濃度為谷濃度，因此確切的采集時間點是確定采集的血藥濃度是否為谷濃度的保證，也是保證試驗應(yīng)用結(jié)果的關(guān)鍵點。

在實際操作中仍發(fā)現(xiàn)有不足。第一，此方法在內(nèi)標(biāo)的選取上是哌拉西林鈉，但哌拉西林鈉屬于ICU經(jīng)常使用的聯(lián)合治療藥物，當(dāng)監(jiān)測到聯(lián)用哌拉西林鈉的患者時，哌拉西林鈉峰會異常，此時無法使用內(nèi)標(biāo)法檢測需改用外標(biāo)法。第二，本實驗選用乙腈—磷酸鹽為流動相，色譜柱易堵塞，樣品分析后需要長時間清洗。以上是后期實驗將要注意與改進的地方。

4.2 推薦給藥劑量下血藥濃度達標(biāo)情況 替考拉寧作為游動放線菌發(fā)酵后提取的糖肽類抗生素，相較于萬古霉素，替考拉寧具有腎毒性低、耐藥性低、更易透入組織和細胞等特點受到醫(yī)生關(guān)注[5]。大部分關(guān)于替考拉寧血藥濃度的研究認為：替考拉林血藥濃度<10 mg/L表示未達到治療所需濃度；濃度在10～<20 mg/L對危重患者抗革蘭陽性菌的感染有療效；應(yīng)對難治的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌研究顯示替考拉寧谷濃度需達到≥20 mg/L；當(dāng)濃度≥60 mg/L時即產(chǎn)生毒性的血藥濃度[6-9]。

本研究中的患者均給予推薦的劑量，精確的血樣采集時間。以10 mg/L為谷濃度的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)替考拉寧血藥濃度達標(biāo)率低。兩次采血點的達標(biāo)率為56.52%和47.83%，變異系數(shù)大。過低的谷濃度會誘發(fā)細菌耐藥，控制感染不佳，延長患者住院時間[10]。過高的血藥濃度也會產(chǎn)生毒性效應(yīng)，本研究中也有超過毒性血藥濃度的例次出現(xiàn)。

本研究還存在一些局限性。第一，本研究納入人數(shù)較少，僅23例，46例次檢驗結(jié)果；第二，僅對濃度進行評價。未關(guān)注與血藥濃度相關(guān)的肌酐清除率等指標(biāo)及臨床效果和不良反應(yīng)的發(fā)生。下一步研究可關(guān)注患者的肌酐清除率或白蛋白[11]等檢測指標(biāo)與替考拉寧血藥濃度之間的關(guān)系，并做分層臨床研究。

綜上所述，本研究建立了替考拉寧血藥濃度靈敏、準(zhǔn)確度高的測定方法，可用于對重癥患者的血藥濃度監(jiān)測。由于患者的病理變化，對藥代動力學(xué)的改變，使得同樣的藥物及給藥方案會在患者身上出現(xiàn)差異較大的結(jié)果的現(xiàn)象發(fā)生。因此，需要具有抗感染專業(yè)知識的藥學(xué)專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)患者其他信息并結(jié)合血藥濃度測定的結(jié)果，給出調(diào)整藥物治療方案(調(diào)整劑量或者更換藥物)的建議。指導(dǎo)合理使用藥物不僅可以在治療開始時就給予有效且安全的劑量，還可以維持治療濃度，提高治療效果，縮短治療時間，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，達到“個體化給藥”的目的。