慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變大鼠造模方法的文獻研究*

陳澤慧，魏 玥，安 靜，彭繼升，黃大未，賈云飛，楊晉翔

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京100029；3.浙江省中醫(yī)院，杭州 310006；4.河南省中醫(yī)院，鄭州 450002）

慢性萎縮性胃炎（CAG）是以胃黏膜腺體萎縮為特點的常見消化性疾病，其發(fā)病緩慢，病勢纏綿，遷延難愈，且伴隨慢性萎縮性胃炎的腸化生和異型增生，常被視為胃癌前病變（PLGC），是胃癌的發(fā)生的高風險因素[1]，因此建立CAG或PLGC動物模型的實驗研究對該病防治具有重要意義。目前多系統(tǒng)綜述表明，CAG動物模型建立為單因素或多因素綜合造模法，根據(jù)與人體相似的病因、發(fā)病機制以及病證結(jié)合的方法進行復制[2-4]，造模方法種類復雜多樣。然而對于不同方法建模的模型評價方面尚未得出統(tǒng)一定論，缺乏相關文獻回顧分析及客觀總結(jié)該病動物模型研究現(xiàn)狀，使得研究者在選擇建立該病動物模型的方法上有一定困擾。故本研究對現(xiàn)階段涉及CAG及PLGC的大鼠造模方法研究做如下整理，旨在為進一步完善該病動物模型研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 文獻來源 計算機系統(tǒng)檢索中國學術期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI）、重慶維普中文期刊數(shù)據(jù)庫（CQVIP）、萬方數(shù)據(jù)庫。檢索范圍：建庫至2018年7月31日。檢索策略：CNKI高級檢索：主題：“慢性萎縮性胃炎”或“CAG”或“胃癌前病變”，在檢索結(jié)果中檢索“大鼠”或“大鼠模型”。CQVIP高級檢索：主題：“慢性萎縮性胃炎”或“CAG”或“胃癌前病變”，在檢索結(jié)果中檢索“大鼠”或“大鼠模型”。萬方數(shù)據(jù)庫專業(yè)檢索式：主題：（“慢性萎縮性胃炎”+“CAG”+“胃癌前病變”）* 主題：（“大鼠”）。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 1）納入與CAG相關的大鼠實驗研究、大鼠模型建立研究等。2）文獻中所涉及大鼠模型建立判定標準均明確符合CAG病理標本診斷。3）文獻中須有明確的造模方法記錄，且造模時間記錄明確。

1.2.2 排除標準 排除文獻綜述類文章。

1.3 文獻篩選及剔除 將全部文獻題錄導入NoteExpress2.0軟件，通過合庫查重，相同文獻題錄按1篇納入。根據(jù)納入及排除標準對每一篇文獻的題目、內(nèi)容、摘要進行閱讀，初步剔除不合格文獻。對經(jīng)過初步篩選后的文獻進行全文下載及閱讀，進行2次篩選。對同一課題研究發(fā)表的多篇相關文獻取內(nèi)容最為詳盡的1篇錄入。對經(jīng)過2次篩選后的文獻錄入Excel軟件進行文獻整理，其中造模方法完全相同的文章按該文引用的最原始文獻錄入。

1.4 統(tǒng)計學方法 將文獻篩選剔除后，將最終的文獻數(shù)據(jù)導入SPSS20.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料方差齊以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時用LSD法，方差不齊時用Dunnett T3法，計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用卡方檢驗，檢驗水平以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻搜索結(jié)果 各數(shù)據(jù)庫檢索文獻數(shù)分別為CNKI 360篇，CQVIP 557篇，萬方數(shù)據(jù)庫1 401篇。經(jīng)查重、篩選與評價，最終納入文獻140篇，涉及造模方法153種。其中13種為單因素造模法，其余140種為復合因素造模法。

2.2 造模方法統(tǒng)計分布

2.2.1 實驗動物概況 153種造模方法中，146種造模方法明確記錄實驗動物性別：94種為雄性動物，45種為雌雄兼?zhèn)洌?種為雌性動物；109種造模方法明確記錄實驗動物年齡：最小為2周齡，最大為30周齡，平均4～6周齡。采用卡方檢驗提示實驗動物品種分布具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；采用卡方檢驗進行兩組大鼠組間比較，結(jié)果提示兩組間不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 實驗動物品種分布Tab.1 Distribution of experimental animal species

2.2.2 造模方法類型分布 對153種造模方法進行整理歸納發(fā)現(xiàn)，13種為單因素造模法，其余140種為復合因素造模法。單因素造模方法中，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）為干預因素的造模方法是以藥物濃度為差異，最大濃度為500 mg/L，最小濃度為1 mg/L，其余濃度波動在80～180 mg/L之間。在復合因素造模方法中，共出現(xiàn)26種干預因素，主要包括化學因素[MNNG、氨水、水楊酸鈉、雷尼替丁、去氧膽酸鈉、乙醇、吲哚美辛、鹽水、小承氣湯/生大黃煎、丙三醇、聚山梨酯、腎上腺素、高脂飼料、甲基硫氧嘧啶（MTU）、阿司匹林、膽汁]16種、物理因素（幽門彈簧術、熱因素胃刺激、涼/冷因素胃刺激、濕度箱、夾尾/情緒刺激/噪音刺激、饑飽失常/禁食、疲勞過度、60 Co照射）8種以及生化因素（免疫注射、Hp菌株）2種。結(jié)果見表2、表3。

表2 單因素造模方法分布Tab.2 Distribution of single factor modeling method

表3 復合因素造模方法中干預因素分布Tab.3 Distribution of intervention factors in composite factor modeling method

2.2.3 造模方法所致胃黏膜組織病理狀態(tài)分布 對納入的153種造模方法進行成模后胃黏膜組織病理學形態(tài)的整理歸納，蘇木精-伊紅（HE）染色后光鏡下胃黏膜的主要病理表現(xiàn)為萎縮、腸化、異型增生、糜爛出血及癌變，且所有造模方法所致的大鼠胃黏膜均可見大量炎癥細胞浸潤，呈現(xiàn)慢性炎癥狀態(tài)。單因素與復合因素造模所致的模型大鼠胃黏膜均以固有腺體減少的胃黏膜萎縮狀態(tài)為主，其中單因素造模所致胃黏膜病理學狀態(tài)分布頻次由多至少依次為：萎縮＞異型增生＞腸化＞糜爛出血=癌變，采用卡方檢驗提示不同干預因素所致病理狀態(tài)為萎縮的分布具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。復合因素造模所致胃黏膜病理學狀態(tài)分布頻次由多至少依次為：萎縮＞腸化＞異型增生＞癌變＞糜爛出血，采用卡方檢驗提示不同干預因素所致病理狀態(tài)為萎縮、腸化及異型增生的分布具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結(jié)果見表4、表5。

表4 單因素造模方法所致胃黏膜組織病理狀態(tài)分布Tab.4 Distribution of pathological state of gastric mucosa caused by single factor modeling method 次

表5 復合因素造模方法所致胃黏膜組織病理狀態(tài)分布Tab.5 Distribution of pathological state of gastric mucosa caused by composite factor modeling method 次

2.2.4 造模時間及死亡率統(tǒng)計 將153種造模方法所用時間按照單因素與復合因素進行比較，單因素造模時間平均為15周左右，復合因素造模時間平均為18周左右。采用卡方檢驗提示兩者平均造模時間不具有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。此外，有關造模期間死亡率方面，有68種造模方法明確記錄造模過程的死亡率，最高死亡率為52%，平均死亡率為12%。結(jié)果見表6。

表6 造模時間分布Tab.6 Distribution of modeling time 次

3 討論

3.1 實驗動物選擇 在實驗動物選擇方面，大鼠為模型建立的最主要來源，而在大鼠品種選擇上，Wistar與SD大鼠不具有統(tǒng)計學差異性。在性別與年齡方面，雄性占比較大，大鼠平均年齡在4～6周齡之間。有研究表明，不同性別與年齡的Wistar大鼠在生理代謝方面存在顯著差異性[5-6]：雌、雄Wistar大鼠的每周攝食量隨年齡增大而增加，食物利用率均在第5周最高，且雄鼠食物利用率高于雌鼠，食物利用率則隨年齡增大而下降，雌鼠的下降趨勢更加明顯。因此可以推斷，經(jīng)胃給藥的建模方法選擇雄性、5周齡左右的實驗大鼠更具一定優(yōu)勢，較高的食藥物利用率可提高造模藥物的吸收。

3.2 造模方法及藥物的應用 在本次文獻整理中，筆者發(fā)現(xiàn)153種造模方法可分為病因造模與病證結(jié)合造模兩大類。病因造模主要通過化學、物理或生化因素模擬各種有害刺激對胃黏膜的持續(xù)損傷，從而導致胃黏膜上皮細胞萎縮甚至出現(xiàn)PLGC。病證結(jié)合造模是在病因造模的基礎上，模擬中醫(yī)部分證候特點，輔助加以導致如肝郁、脾虛、濕熱等外部刺激，表現(xiàn)出具有中醫(yī)證候癥狀特點的動物模型。根據(jù)CAG的發(fā)病機制，病因造模主要分為以下幾種：1）感染：幽門螺桿菌感染（Hp 菌株、氨水）[7-8]。2）胃黏膜損傷：膽汁反流（膽汁、幽門彈簧術、去氧膽酸鈉）、免疫因素（免疫注射）、非甾體抗炎藥（水楊酸鈉、阿司匹林、吲哚美辛）[9-16]。3）不良生活習慣：飲食不規(guī)律（饑飽失常/禁食）、飲酒（乙醇）、高鹽飲食（鹽水）、過熱飲食（熱因素胃刺激）、生冷飲食（涼/冷因素胃刺激）、情志因素（夾尾/情緒刺激/噪音刺激）[17-24]。4）其他：致癌劑（MNNG、60 Co照射、AAI）、抑酸劑（雷尼替丁）[25-30]。病證結(jié)合模型的復制均在上述病因造模的基礎上進行，本次文獻整理涉及以下4種：1）脾虛造模：小承氣湯/生大黃煎、勞累過度。2）肝郁造模：夾尾/情緒刺激、腎上腺素。3）腎虛造模：MTU。4）濕熱造模：高脂飼料、濕度箱[16，31-36]。在153種造模方法中，病證結(jié)合造模方法31種，造模方法主要以病因造模為主。病因造模是符合西醫(yī)學病理學模型特點，模型評價可參考、可量化，通過慢性萎縮性胃炎病理診斷標準即可判斷造模情況，因此成為造模方法的主流。對于病證結(jié)合造模方法而言，體現(xiàn)了中醫(yī)證候?qū)W特征，能很好地反應中醫(yī)中藥辨證論治的核心理論，某種程度上來說，病證結(jié)合造模是單純病因造模的一種改革創(chuàng)新。然而目前學者對病證結(jié)合造模方法的評價不一，認為該方法仍存在尚未解決的問題：如缺乏客觀的指標評價以及公認的造模方法[37]，甚至有學者評價這種病證結(jié)合造模方法割裂了病與證的聯(lián)系，不符合中醫(yī)臨床實踐，也不符合中醫(yī)理論的要求[2]?？傮w來說，由于病證結(jié)合模型建立具有一定爭議性，研究者采取該種方法建模雖未普遍應用，但不可否認的是，病證結(jié)合模型的探索對于中醫(yī)證候?qū)W以及中藥藥理的研究有重要意義。

此外，有關造模藥物的選擇上，不論是單因素造模還是復合因素的模型建立，MNNG相較其他藥物而言更為普遍。MNNG作為一種化學誘癌劑，主要模擬在胃內(nèi)轉(zhuǎn)化的亞硝酸胺等致癌物質(zhì)導致CAG、PLGC甚至胃癌發(fā)生的過程[38]。當化學致癌物MNNG短時刺激胃上皮細胞后，胃上皮細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞遷移能力增強，并且發(fā)生上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，促使胃上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)變[39]。由于MNNG的給藥途徑以及聯(lián)合其他多因素的差異性，通過文獻整理發(fā)現(xiàn)其濃度與造模周期、濃度與死亡率之間并未呈現(xiàn)一定規(guī)律性，原因可能推測如下：1）MNNG水溶性較差，且大部分文獻未明確標出溶解方法，從而導致配液濃度可能出現(xiàn)偏頗。2）不同文獻的單因素造模方法（MNNG）在給藥途徑相同的情況下，濃度雖有差異性，但實驗大鼠不同性質(zhì)的影響（品種、周齡）或可導致藥物濃度與造模周期、死亡率未呈現(xiàn)一致性規(guī)律。3）有關研究MNNG濃度、給藥途徑與造模周期、造模死亡率相關規(guī)律性的文獻研究鮮少，文獻整理結(jié)論具有一定局限性，并且有部分文獻研究MNNG在量效、給藥途徑對模型的影響中配合其他造模影響因素[38，40]，不排除其他因素造成干擾的可能。因此在使用MNNG誘導的胃癌前病變模型建立時，有學者認為MNNG的濃度控制在80～250 mg/L，給藥方式以自由飲用與灌胃相結(jié)合，適當使用增溶劑可使造模效果更為理想[41]。

3.3 CAG動物模型評價 對于模型評價方面，本次研究發(fā)現(xiàn)納入的153種造模方法中，涉及造模成功的病理診斷標準主要參照以下幾種[42-47]：《中藥新藥臨床研究指導原則》、全國胃癌防治研究協(xié)作組制定的標準、2012中國上海慢性胃炎共識意見以及2017年中國慢性胃炎共識意見。上述標準均具備以下診斷條件：存在固有腺體萎縮，黏膜肌層增厚，可有腸上皮化生或假幽門腺上皮化生，其中PLGC包括腸上皮化生和異型增生，主要伴存于CAG。通過不同因素的作用刺激，胃黏膜萎縮是模型中最常見的病理學改變，并且隨著建模時間的延長，可出現(xiàn)PLGC甚至癌變。單因素造模方法中，應用MNNG干預更易造成PLGC狀態(tài)；復合因素模型中，干預因素以化學與物理因素結(jié)合的造模方法最多，其次為化學因素刺激、理化生3種因素共同刺激，而化學因素干預是造成PLGC與癌變的主要及重要刺激因素。雖然經(jīng)流行病學調(diào)查已確定Hp感染是慢性胃炎最主要的致病因素，但在CAG動物模型的復制中，生物因素并不是誘發(fā)CAG以及PLGC的重要致病原因，因此在制備CAG動物模型的病因模擬復制方面，更推薦以化學因素為主的干預方法來刺激胃黏膜持續(xù)損傷而致胃黏膜萎縮等相關病變發(fā)生。

除此之外，造模周期與造模期間的死亡率是對實驗動物模型評價中較為重要的因素之一。筆者通過對153種造模方法的造模時間、死亡率進行有效統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，單因素與復合因素在平均造模時間上并未有統(tǒng)計學差異性，平均造模周期大致15～18周左右。臨床研究提示CAG患病率與年齡呈正相關[48]，隨著年齡增大發(fā)病率有增加趨勢，從正常胃黏膜發(fā)展至胃黏膜上皮細胞萎縮、甚至胃癌前病變是相對漫長的過程，這與CAG或PLGC實驗動物模型的長周期制備相呼應。可以看出，不論是單因素還是復合因素的造模方式，平均造模周期并無明顯差異性，說明決定該病動物模型造模周期的關鍵性因素并不是方法種類，而是CAG本身具有較長的病程特點。而PLGC的發(fā)生甚至更為漫長，實驗動物建模周期平均在24～36周左右[49-50]。此外，造模時期的死亡率也是研究者關注的重點。本次整理涉及的153種造模方法只有68種明確記錄造模過程的死亡率，平均死亡率為12%。實驗動物死因主要為灌胃操作不當導致嗆咳窒息，實驗動物體質(zhì)較差，不能耐受長周期藥物等各種因素刺激。死亡動物的解剖多見肺充血水腫、胃腸脹氣明顯以及消化道腫瘤的出現(xiàn)。由此可見，造模的給藥途徑、藥物濃度以及造模給予刺激量的多少是影響死亡率的重要因素，需要研究者在選取造模方法時考慮上述因素來進行建模預評估，此外，根據(jù)CAG造模過程的平均死亡率推算，可為研究者在實驗動物樣本量估算方面給予一定參考。

目前，較長建模周期與較高死亡率是現(xiàn)階段CAG實驗動物模型研究的難點，通過文獻整理肯定研究者在不斷探索研究的同時，也發(fā)現(xiàn)存在某些問題有待解決。在造模方法方面，本次文獻回顧整理提示MNNG為造模的重要與普遍用藥之一，但探究單因素MNNG的濃度、給藥途徑與造模周期、造模過程死亡率的文獻極少，作為造模主要用藥可進行更加深入的研究。此外，病證結(jié)合造模是具有中醫(yī)特色的創(chuàng)新性方法，但模型評價的不統(tǒng)一性使得該方法共識度尚缺乏，然而在研究通過中醫(yī)藥辨證施治該病的動物實驗中，涉及證型劃分的實驗動物模型是不可回避的因素，因此不斷完善病證結(jié)合的實驗動物模型顯得頗有意義。在模型評價方面，本次文獻回顧主要針對造模周期與造模過程死亡率而談，而真正的造模成功率并未涉及，主要原因為造模成功率指造模成功樣本量除以造?？倶颖玖浚枰谠炷＝Y(jié)束后將現(xiàn)存實驗動物全部處死取胃。本次文獻整理發(fā)現(xiàn)，涉及CAG動物建模的文獻絕大部分為治療性實驗研究，判定造模成功的標準并不是造模成功率，而是造模結(jié)束后從造模組隨機抽取少量樣本篩查，若病理標本符合CAG診斷標準，則判斷造模成功，并繼續(xù)進行下階段干預實驗。這種判定方式受到研究者們廣泛公認與接納，但不可否認的是，該方式并不完全等于造模成功率，因此，篩選出造模成功率較高、死亡率較小、造模周期較短的理想造模方法，這需要研究者們在CAG模型建立方面做更加細致、深入的研究。